Research progress on the protective mechanism of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 inhibitors on vascular endothelium
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摘要:
前蛋白转化酶枯草溶菌素-kexin9型抑制剂(PCSK9抑制剂)不仅具有良好的降脂作用, 还具有改善心血管结局、减轻氧化应激及改善血管内皮等多效性作用。近年来, PCSK9抑制剂的不断研发为心血管疾病治疗提供了新思路，本文就PCSK9抑制剂的多效性作用机制研究，尤其是对于血管内皮功能的作用机制研究予以综述。
Abstract:Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) inhibitors not only have good lipid-lowering effects, but also have pleiotropic effects such as improving cardiovascular outcomes, relieving anti-inflammation, relieving oxidative stress and improving vascular endothelium. In recent years, the continuous development of PCSK9 inhibitors provides new ideas for the treatment of cardiovascular diseases. This article reviewed the pleiotropic mechanisms of PCSK9 inhibitors, especially on vascular endothelial function.
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血管内皮功能障碍是导致动脉粥样硬化的重要因素之一[1]。前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)不仅参与脂类代谢，还参与了动脉粥样硬化的形成。前蛋白转化酶枯草溶菌素-kexin9型抑制剂(PCSK9抑制剂)作为一类新型的降脂药，除了具有降脂作用，还具有改善血管内皮功能等多效性作用。近年来对于PCSK9抑制剂的不断研发为心血管疾病的防治提供了新思路。本文就PCSK9抑制剂的多效性作用机制研究，尤其是对于血管内皮功能的作用机制研究予以综述。
1. PCSK9抑制剂的多效性
1.1 降脂
血浆里的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和低密度脂蛋白受体(LDL-R)结合以后进入细胞，和溶酶体融合后，在溶酶体水解酶作用下进行水解。PCSK9是脂类代谢的关键蛋白, PCSK9与LDL-R结合后, LDL-R被降解，从而减少了LDL-C的清除[2]。PCSK9抑制剂通过与PCSK9分子结合，抑制了其与LDL-R结合，从而降低了该受体的降解，也因此提高了对血浆中LDL-C的摄取，从而降低了其浓度[3]。早期的Ⅱ期临床试验表明, PCSK9抑制剂能够有效地减少LDL-C(至少40%)[4-5]。对于接受最大耐受剂量他汀治疗后LDL-C仍未达标的动脉粥样硬化性心血管疾病极高危患者，在接受12个周的PCSK9抑制剂治疗后，超过90%的患者实现了既定的降脂目标[6]。此外，接受PCSK9抑制剂联合他汀治疗的高脂血症患者，在给予PCSK9抑制剂治疗3个月后LDL-C较基线水平显著下降(至少40%)[7]。在OSLER研究中，对于继续进行PCSK9抑制剂治疗的患者来说，用药期间LDL-C水平降幅保持在50%左右，而对于未继续接受治疗的患者，其LDL-C水平最终恢复至基线水平[8]。对于接受PCSK9抑制剂治疗组，其他非主要干预靶点如非高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯及脂蛋白(a)水平均出现不同程度下降，但高密度脂蛋白胆固醇的含量增加。OSLER-1研究发现, PCSK9抑制剂对于高脂血症患者具有持久有效性和良好耐受性[9]。在PCSK9抑制剂的Ⅲ期临床研究中, MENDEL-2研究发现, PCSK9抑制剂单药治疗12个周是安全、有效的[10]。LAPLACE-2研究发现，在联合用药方面，在基线LDL-C水平接近情况下, 12个周后联合PCSK9抑制剂组LDL-C显著降低且安全可耐受[11]。对于稳定型冠心病患者，不管是接受高强度他汀治疗还是次高强度他汀治疗，且无论基线水平LDL-C是否 < 700 mg/L, PCSK9抑制剂都能够继续稳定降低LDL-C水平[4]。
1.2 改善心血管结局
依洛尤单抗和阿利西尤单抗作为PCSK9抑制剂，对其早期Ⅱ期研究的事后分析显示，与安慰剂相比，使用PCSK9抑制剂治疗的患者的心血管事件较少[12-13]。PCSK9抑制剂的心血管结局试验(FOURIER研究)比较了依洛尤单抗每2周140 mg或每月420 mg或安慰剂对27 564例他汀类药物治疗的冠状动脉疾病和LDL-C水平至少为70 mg/L的患者心血管事件的影响。接受依洛尤单抗治疗的患者LDL-C水平显著降低(30 mg/L比92 mg/L)。经过2.2年的随访，使用依洛尤单抗治疗的患者出现主要不良心血管事件的风险显著减少，降低了有15%, 所达到的LDL-C水平与主要不良心血管事件发生率之间存在线性关系[14]。ODYSSEY研究显示, 18 924例1年内发生过急性冠脉综合征的患者在接受他汀类药物治疗基础上，与应用安慰剂相比，阿利西尤单抗降低了主要不良心血管事件(MACE)的发生率。在治疗过程中，阿利西尤单抗组的LDL-C水平较低。中位随访时间为2.8年后, MACE发生率下降了15%。而且阿利西尤单抗组病死率较低(3.5%比4.1%)。此外，长期服用PCSK9抑制剂可以降低心血管疾病的风险，心血管疾病死亡率也有统计学意义上的降低[15]。PCSK9抑制剂的使用不仅降低了首次心血管事件的风险，而且降低了随后和复发事件的风险[16]。PCSK9抑制剂的益处与LDL-C降低的程度有关，且进一步研究表明，用这些药物降低脂蛋白(a)与其临床益处独立相关[17-18]。王同等[19]研究发现入院早期应用PCSK9抑制剂能提高心肌再灌注量，从而有效地改善患者心脏功能及预后。
1.3 抗炎
体内外研究[20]表明, PCSK9与炎症密切相关, PCSK9抑制剂可能发挥抗炎作用。MARFELLA R等[21]在接受颈动脉内膜切除术治疗的患者中评估了PCSK9抑制剂的抗炎作用，结果显示, PCSK9抑制剂有效降低了患者的Nod样受体热蛋白结构域蛋白3(NLRP3炎性体)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1(caspase-1)蛋白的表达，同时降低了白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和核因子Kappa B(NF-κB)蛋白水平。该研究提示与接受其他降脂药(OLLD)治疗的患者相比, PCSK9抑制剂治疗的患者斑块中特异性炎症负荷较低。由于血管壁中的炎症反应被认为与LDL-C水平直接呈正比[22], 他们比较了LDL-C < 100 mg/L患者的炎症蛋白表达。在这些LDL-C匹配的亚组中，与接受OLLD治疗的患者相比，接受PCSK9抑制剂治疗的患者斑块内炎性蛋白的丰度较低。KÜHNAST S等[23]在家族性高胆固醇血症(FH)患者的小鼠模型中进行的研究表明，阿利西尤单抗通过减少内皮细胞中细胞间黏附分子-1(ICAM-1), 从而降低了大单核细胞对血管内皮的黏附。此外，该研究表明，阿利西尤单抗减少了其他血管炎症标志物，包括主动脉根部区域的T细胞丰度，以及病变的巨噬细胞、坏死内容物和胆固醇结晶。BERNELOT MOENS S J等[24]在FH患者中进行的研究表明, PCSK9单克隆抗体降低单核细胞表面趋化因子受体2(CCR2)表达、迁移能力和脂质积累。本研究发现炎症促进因子下调和炎症抑制因子白细胞介素-10(IL-10)上调。另一项研究[25]表明, PCSK9 siRNA通过抑制NF-κB的核转位，抑制PCSK9和参与动脉粥样硬化白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)和TNF-α的形成。
1.4 减轻氧化应激
研究[26]表明PCSK9与氧化应激之间存在联系，因此抑制PCSK9可能发挥减轻氧化应激作用。CAMMISOTTO V等[27]报道, PCSK9抑制剂依洛尤单抗可降低杂合子FH患者(家族性高胆固醇血症患者的1条同源基因存在杂合子突变，产生一半具有正常结构和功能的LDL-R)的血清氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)浓度。依洛尤单抗能抵消过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤[28]。YANG J J等[29]研究表明, PCSK9抑制剂降低了ApoE缺陷小鼠主动脉根斑中氧化应激对线粒体DNA损伤的ROS生成和8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)表达，此外其还观察到PCSK9抑制剂降低了高脂饮食(HFD)喂养的ApoE小鼠和氧化应激的人单核细胞白血病细胞(THP-1)衍生巨噬细胞的炎症反应。既往研究[28]表明, PCSK9抑制剂依洛尤单抗抵消了内皮细胞氧化应激引起的损伤。因此，PCSK9抑制剂可能通过减少与动脉粥样硬化炎症和内皮功能障碍相关的氧化应激来减轻动脉粥样硬化病变。据报道[30], PCSK9抑制剂通过调节氧化应激来抑制血小板活化和体内血栓形成。此外，接受PCSK9抑制剂治疗的急性冠脉综合征患者表现出氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)水平降低，这是氧化应激的关键指标。因此, PCSK9抑制剂可能为降低与氧化应激相关的心血管风险提供治疗策略。SILLA A等[31]研究表明，用PCSK9抑制剂依洛尤单抗治疗改善高胆固醇血症和高心血管风险患者的血管氧化应激和动脉硬度。
1.5 激活自噬
许多研究[32-33]表明，自噬是维持脂质稳态和预防血管动脉粥样硬化所必需的。在动脉粥样硬化发育过程中，巨噬细胞自噬受损会促进脂质积累[34]、过度炎症反应[35]、活性氧(ROS)生成增加和氧化应激[36]。为了研究PCSK9抑制对动脉粥样硬化进程中自噬的影响, YANG J J等[29]评估了喂食HFD的ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠中自噬标记物的蛋白质表达。Western blot分析显示，与常规饮食(RD)喂养的ApoE-/-小鼠相比, HFD喂养的ApoE-/-小鼠微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)显著降低, P62蛋白表达显著增加。在HFD喂养的ApoE-/-小鼠中，用PCSK9抑制剂依洛尤单抗治疗明显增加LC3-II和降低P62蛋白表达。此外，依洛尤单抗治疗增加巨噬细胞自噬。这些结果表明, PCSK9抑制增强动脉粥样硬化进展中巨噬细胞自噬。此外他们还研究了PCSK9抑制剂对ox-LDL诱导的THP-1来源的巨噬细胞自噬的影响。该研究发现依洛尤单抗显着促进ox-LDL诱导的THP-1来源的巨噬细胞中的LC3-Ⅱ蛋白表达，且抑制了P62蛋白表达。此外，免疫荧光染色表明依洛尤单抗治疗增加了ox-LDL诱导的THP-1衍生的巨噬细胞中LC3斑点的数量，表明PCSK9抑制剂增加了自噬体的水平。同时，该研究探讨了PCSK9抑制剂对脂质沉积巨噬细胞自噬通量的影响，将慢病毒-RFP-GFP-LC3转染THP-1来源的巨噬细胞。结果显示PCSK9抑制剂依洛尤单抗增强ox-LDL诱导的THP-1衍生的巨噬细胞中的自噬通量。这些数据表明PCSK9抑制剂增强了ox-LDL诱导的THP-1衍生的巨噬细胞的自噬通量，促进自噬。见图 1。
2. PCSK9抑制剂的作用机制
目前PCSK9抑制剂已经被广泛应用，其中包括依洛尤单抗注射液、阿利西尤单抗注射液和英克司兰钠注射液等。总的来说, PCSK9抑制剂可以大致划分为4类: 单克隆抗体抑制剂、核酸药物、小分子以及疫苗药物。
(1) 单克隆抗体抑制剂，如依洛尤单抗和阿利西尤单抗。PCSK9单克隆抗体阻断了PCSK9和LDL-R之间的相互作用，有效抑制了LDL-R的降解，从而减少了LDL-C水平。类似肽阻断了LDL-R的EGF-A结构域与PCSK9的结合，从而起到抑制PCSK9的作用。单克隆抗体可以与PCSK9特异性结合，阻断PCSK9与LDL-R的相互作用，降低了LDL-R的降解，从而降低了LDL-C的血浆水平，其有效性已在临床试验中证实[37]。(2) 核酸药物，如反义寡核苷酸(ASOs)、siRNA和CRISPR/Cas9等。ASOs通过Watson-Crick碱基对相互作用与 PCSK9 靶基因的mRNA结合，从而阻碍了靶基因的表达。研究人员已经开发出具有口服潜力的ASO药物AZD8233, 这是一种高效的16核苷酸寡聚物，与N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)相连。这种药物使用Galnac-ASO靶向 PCSK9 mRNA, 抑制细胞核中PCSK9的表达，增加LDL-R数量，从而降低血浆总胆固醇和LDL-C浓度。siRNA可以抑制特定序列的mRNA降解，从而阻碍PCSK9基因表达，进而影响蛋白质的合成[38]。诺华公司开发的核酸抑制剂英克司兰钠是一种双链siRNA, 可引起肝脏中 PCSK9 mRNA的降解，阻断PCSK9蛋白的合成。这增加了LDL-C受体的再循环和在肝细胞表面的表达，从而增加了肝脏对LDL-C的摄取，降低了循环中的LDL-C。CRISPR/Cas9可以通过诱导宿主细胞DNA双链断裂，从而引发错配、重组和非同源末端连接，进而有效地抑制PCSK9靶基因的表达[39]。研究[40]表明, CRISPR/Cas9靶向KO药物在缓解血脂异常方面具有很高的潜力。CRISPR/Cas9靶向药物主要是通过其Cas9核酸酶和小向导RNA(sgRNA)切割DNA靶序列，将药物导向特定的基因组区域。(3) 小分子，如BMS-962476。小分子类药物能够使PCSK9蛋白发生变构，进而影响PCSK9和LDLR的结合[41]。PCSK9蛋白的结合界面比较开放、平坦，小分子接触面积很少，因此产生的疏水力不强。即使其与PCSK9蛋白结合，也可能在天然大分子配体的作用下解离。因此，小分子药物的研究和开发存在一些困难，但已经取得了一些进展。BMS-962476是由纤维结合蛋白组成的，具有极强的亲和性，可竞争性结合PCSK9, 从而有效阻止PCSK9-LDL-R复合物的形成。(4) 疫苗药物，如L-IFPTA +疫苗，可以抑制循环PCSK9活性[42]。研究人员在脂质体纳米颗粒(LNP)表面构建了融合PCSK9-破伤风蛋白的免疫原性肽构建体(IFPT), 然后将其混合到明矾佐剂中[43]。L-IFPTA+疫苗对PCSK9的IgG反应最高，可诱导产生PCSK9抗体。该抗体直接靶向并消除血液中的循环PCSK9, 这抑制了PCSK9-LDL-R相互作用并增加了肝脏LDL-R蛋白[44]。此外，诱导的抗体持续存在，在注射疫苗16周后测量抗体滴度，发现抗体滴度仍然很高。L-IFPTA疫苗有可能成为单克隆抗体治疗的有效替代方案，用于控制胆固醇水平升高和预防心血管疾病[45]。
3. PCSK9抑制剂对血管内皮功能的影响机制
在人和各种实验模型中可以观察到, PCSK9抑制剂在保护血管内皮细胞功能方面发挥重要作用。D′ONOFRIO N等[46]研究表明, PCSK9抑制剂改善了IL-6(心血管疾病的主要驱动因素)诱导的内皮细胞炎症通路的活化、氧化应激和自噬。抑制沉默调节蛋白3(SIRT3)逆转了PCSK9抑制剂对炎症、线粒体氧化应激和自噬的影响。他们还发现，在动脉粥样硬化标本中, PCSK9的表达与SIRT3的表达呈负相关，与IL-6、IL-1β及LC3B Ⅱ/Ⅰ比值呈正相关，并且IL-6与LC3B Ⅱ/Ⅰ呈显著正相关，与IL-1β呈临界相关。这些数据提示PCSK9抑制剂在内皮细胞中具有内在的抗炎、抗自噬和抗氧化剂特性，并且这些多效性作用可能至少部分由SIRT3介导。这些结果支持PCSK9抑制剂在降低LDL-C之外对心血管疾病有益的新知识，并发现SIRT3是这种多效性的潜在介质。KONG N等[47]研究结果表明，英克司兰钠主要通过抑制ox-LDL诱导的NLRP3活化，然后阻碍凋亡相关颗粒样蛋白(ASC)和caspase-1的活化，从而阻碍炎性细胞因子的成熟形态，并最终抑制内皮细胞焦亡来发挥抗动脉粥样硬化功能。FH与低度全身炎症有关，低度全身炎症是动脉粥样硬化过早的关键驱动因素。MARQUES P等[48]研究显示，阿利西尤单抗减弱了白细胞与TNF-α刺激的HUAECs的附着，抑制了血小板和大多数白细胞亚群的活化，并伴随着CX3C趋化因子受体1(CX3CR1), 细胞表面趋化因子受体6(CXCR6)和CCR2在几个白细胞亚群上的表达减少。体外分析显示, TNF-α刺激HUAECs增加PCSK9的表达，而内皮PCSK9沉默减少TNF-α诱导的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶5(Nox5)上调和p38-MAPK/NF-κB激活介导的单核细胞黏附，同时降低胆固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)表达。PCSK9沉默也降低了内皮(趋化因子C-X3-C-基元配体1)CX3CL1和CXC趋化因子配体16(CXCL16)表达和趋化因子生成。总之, PCSK9抑制通过限制白细胞-内皮相互作用来减轻全身炎症和内皮功能障碍。PCSK9阻断可能构成一种新的治疗方法，以控制与FH相关的炎症状态，防止这种心脏代谢紊乱的进一步心血管事件。PUSPITASARI Y M等[49]研究提示，阿利西尤单抗对人血管平滑肌细胞和内皮细胞产生相反的作用。具体而言, PCSK9抑制剂抑制内皮细胞迁移并促进衰老，而血管平滑肌细胞则表现出相反的作用。PCSK9抑制剂对血管平滑肌细胞与内皮细胞的相反作用仍需要在颈动脉支架的体外实验中进一步验证。
MINNO A D等[50]研究观察到FH患者接受依洛尤单抗治疗后内皮功能有所改善，这可能与低密度脂蛋白的减少存在关联，需要进一步的研究来调查潜在机制。MAULUCCI G等[51]通过肱动脉血管反应性试验研究了PCSK9抑制剂对既往心肌梗死患者内皮功能的影响。研究表明，依洛尤单抗140 mg治疗2个月可以改善患有高胆固醇血症和既往心肌梗死患者的内皮功能，内皮功能的改善与低密度脂蛋白的降低呈正比。SCHREMMER J等[52]在冠心病患者中进行的临床研究表明, 6个月的PCSK9抑制剂治疗改善了内皮功能和外周微循环，同时降低了动脉僵硬度。他汀类药物背景治疗倾向于显示更大的内皮功能和动脉僵硬度参数的改善。尽管PCSK9抑制剂在保护血管内皮功能方面展现出良好的前景，但仍需要更多的研究来探究其改善血管内皮功能的作用及机制。
4. 小结与展望
越来越多的研究发现PCSK9抑制剂具有多种降脂之外的作用，包括改善心血管结局、抗炎、减少氧化应激及改善血管内皮功能等。但目前临床上的PCSK9抑制剂以单克隆抗体为主，随着进一步的研究，将会有越来越多的PCSK9特异性抑制剂相继问世。此外，值得注意的是, ZHANG S等[53]研究发现，对于冠心病合并肾功能受损的患者，联合应用PCSK9抑制剂有利于提高患者的血脂达标率。SKEBY C K等[54]研究提示, PCSK9抑制剂可以在一定程度上减轻肾病患者的蛋白尿。一项荟萃分析[55]显示，与安慰剂组相比，加用PCSK9抑制剂可使卒中相对风险降低26%, 且这种效应不受既往卒中病史或基线LDL-C水平影响。同时，该分析也证明PCSK9抑制剂具有良好的安全性，没有增加出血性卒中风险[56]。因此, PCSK9抑制剂不仅有利于心血管疾病的治疗，而且为肾病及脑血管疾病患者的治疗提供了一种新的可能性。其他疾病领域也可以适当参考PCSK9抑制剂在心血管疾病领域的循证医学证据、临床实践经验和基础研究，以期进一步扩大PCSK9抑制剂的临床使用范围。
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1. 王镕，况春燕. 基于网络药理学和分子对接研究当归四逆汤治疗稳定型心绞痛的作用机制. 河南中医. 2024(12): 1880-1887 . 
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