Molecular mechanism of regulating miR-223-3p/RHOB expression by circRNA SAMD8 to inhibit progression of pancreatic ductal adenocarcinoma
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摘要:目的
探讨环状RNA SAMD8(circ-SAMD8)在胰腺导管腺癌(PDAC)进展中的潜在机制。
方法基于Microarray数据(GSE79634)分析PDAC组织中circRNAs的表达谱。通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证circ-SAMD8(hsa_circ_0006148)在PDAC组织和细胞(CFPAC-1和PANC-1)中的表达。采用生物信息学分析预测circ-SAMD8的靶微小RNA(miRNA)及其下游mRNA, 并采用双荧光素酶报告基因实验进行鉴定。采用MTT法和集落形成法检测PDAC细胞的增殖能力。采用免疫印迹法(Western blot)检测抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达水平。采用流式细胞术检测凋亡细胞百分比。
结果circ-SAMD8在PDAC组织和细胞中的表达水平低于癌旁组织和正常细胞，差异有统计学意义(P < 0.05)。过表达circ-SAMD8能有效促进PDAC细胞凋亡，抑制PDAC细胞增殖。双荧光素酶报告基因实验显示, miR-223-3p是circ-SAMD8的一个潜在相互作用分子, miR-223-3p的下游mRNA靶点是RHOB。miR-223-3p在PDAC组织和细胞中异常过表达，并伴有RHOB低表达。在转染miR-223-3p模拟物或sh-circ-SAMD8的PDAC细胞中, RHOB表达显著降低，增殖能力增强，凋亡率降低。
结论circ-SAMD8通过海绵化miR-223-3p, 调控下游RHOB的表达，有效抑制PDAC的发生发展。
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关键词:
- 胰腺导管腺癌 /
- 环状RNA SAMD8 /
- 微小RNA-223-3p /
- RHOB基因 /
- 靶点 /
- 细胞增殖
Abstract:ObjectiveTo investigate the potential mechanism of circRNA SAMD8(circ-SAMD8) in development of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC).
MethodsThe expression profile of circRNAs in PDAC tissues was analyzed based on Microarray data (GSE79634). Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to verify the expression of circ-SAMD8 (hsa_circ_0006148) in PDAC tissues and cells (CFPAC-1 and PANC-1).The target microRNA (miRNA) of circ-SAMD8 and its downstream mRNA were predicted by bioinformatics analysis, and identified by double luciferase reporter gene assay. The proliferation ability of PDAC cells was detected by MTT assay and colony formation assay. The expression levels of anti-apoptotic protein Bcl-2 and pro-apoptotic protein Bax were detected by Western blot. The percentage of apoptotic cells was detected by flow cytometry.
ResultsThe expression levels of circ-SAMD8 in PDAC tissues and cells were significantly lower than those in paracancer tissues and normal cells (P < 0.05). Overexpression of circ-SAMD8 could effectively promote apoptosis of PDAC cells and inhibited proliferation of PDAC cells.Dual luciferase reporter gene experiments showed that miR-223-3p was a potential interacting molecule of circ-SAMD8, and the downstream mRNA target of miR-223-3p was RHOB. The miR-223-3p was abnormally overexpressed in PDAC tissues and cells, accompanied by low RHOB expression. In PDAC cells transfected with miR-223-3p mimics or sh-circ-SAMD8, RHOB expression was significantly decreased, proliferation ability was enhanced, and apoptosis rate was decreased.
ConclusionCirc-SAMD8 regulates the expression of RHOB downstream by sponging miR-223-3p, and effectively inhibits the occurrence and development of PDAC.
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Keywords:
- pancreatic ductal adenocarcinoma /
- circRNA SAMD8 /
- microRNA-223-3p /
- RHOB gene /
- target /
- cell proliferation
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胰腺导管腺癌(PDAC)是最具侵袭性的胰腺癌之一，约占所有由胰腺引起的主要恶性肿瘤的90%[1], 尽管近年来进行了许多基于PDAC的研究，且已经证明了许多生物标志物在PDAC的诊断和治疗中的有效性[2], 但对现有治疗的反应差仍然是PDAC临床治疗的主要影响因素[3]。因此，了解PDAC的病理学并进一步探索该疾病的分子机制非常重要。
环状RNA(circRNA)在真核转录组中占据了重要位置[4], 其作为一种重要的基因表达调节因子，在大多数哺乳动物中作为内源性非编码RNA的一种重要形式[5]。CircRNA通常作为微小RNA(miRNA)竞争性吸附参与调控基因表达[6]。研究[7]表明, circRNA在癌症发展中发挥了重要作用，但circRNA在人类PDAC中的功能和机制仍未阐明。miRNA在调节多种生物过程中起重要作用，包括细胞增殖和迁移。然而，miR-223-3p在PDAC中所起的确切功能和分子机制仍未明确。本研究探讨circ-SAMD8在PDAC进展中的潜在机制，以期为PDAC提供新的诊断生物标志物或治疗靶点。
1. 材料与方法
1.1 临床组织
PDAC及其癌旁组织来自本院病理科诊断的20例PDAC患者，所有患者签署知情同意书。PDAC及其癌旁组织在切除后，立即冷冻于液氮中，然后在-80 ℃保存用于后续分析。在样本收集之前，患者没有接受任何治疗，包括化学放疗和其他针对肿瘤的治疗。本研究已获得本院伦理委员会的批准(伦理批号: KY2021052661)。
1.2 细胞培养
人类PDAC细胞系CFPAC-1和PANC-1以及正常胰腺导管上皮细胞系HPDE6-C7由柯拜尔生物科技有限公司(中国南京)提供，置于含有青霉素(100 U/mL)、链霉素(100 μg/mL)和10%胎牛血清(Giblo, 美国)的DMEM培养基中，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
1.3 微阵列分析
从GEO数据集(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载了包含20个PDAC患者的肿瘤组织和癌旁组织的circRNA表达数据集(GSE79634)。使用GPL19978平台分析GSE79634的微阵列表达谱，选择Log2FC>2和P＜0.05作为具有显著不同表达的circRNA的阈值。
1.4 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
使用TRIzol RNA试剂(Invitrogen, 美国)从组织和细胞中提取总RNA。通过NanoDrop-2000(Thermo Fisher Scientific, 美国)进行定量后，使用TransScript逆转录酶(TransGen Biotech, 中国)将200 ng总RNA逆转录为互补DNA。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)产物(即cDNA)作为进一步实时定量PCR的模板，其中circRNA及mRNA使用SYBR Green I PCR Master Mix(Roche, 瑞士)进行实验，而miRNA检测采用miRcute miRNA荧光定量检测试剂盒进行实验(天根，中国)。PCR程序包括94 ℃预变性步骤，持续2 min, 然后进行30个循环: 94 ℃变性2 min, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 最后在72 ℃进行5 min的初始延伸。使用2-△△Ct方法计算circRNA和miRNA的相对表达量，内参为GAPDH、 U6 。qRT-PCR的引物序列见表 1, 其中miRNA引物设计采用加Ploy-A尾法设计原则。
表 1 引物序列基因名称 引物 引物序列 miR-223-3p 上游引物 5′-CGTCCTGTCAGTTTGTCAAAT-3′ 下游引物 5′-AACTGACACTCTACCACATGGA-3′ circ-SAMD8 上游引物 5′-GCGGTTCACAGTGGCTAAGTTC-3′ 下游引物 5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′ SAMD8 上游引物 5′-GTGGACGCTCTTCAGTTCCT-3' 下游引物 5′-CGTCCACACCGCCACTT-3′ RHOB 上游引物 5′-GAAGGAACGGAATCGCAACAA-3′ 下游引物 5′-TGGCATAGGCAGGAAGAAGAG-3′ U6 上游引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′ 下游引物 5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′ GAPDH 上游引物 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′ 下游引物 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′ 1.5 RNase R消化
将2 μg总RNA与6 U RNase R在37 ℃孵育20 min。经过2次RNase R消化后，产物使用RNEasy Mini Kit(QIAGEN, 德国)进行回收，然后进行上述定量PCR。
使用商业试剂盒(QIAGEN)从PDAC及其癌旁组织中提取基因组DNA(gDNA)。提取的gDNA和构建的cDNA作为模板，分别使用发散引物或汇合引物进行常规PCR。然后，通过1.5%琼脂糖凝胶电泳可视化PCR产物; GAPDH作为线性RNA对照。
1.6 sh-circ-SAMD8表达载体的构建
使用BLOCK-iTTM RNAi Designer(Invitrogen), 一种RNA干扰序列设计软件，设计了针对circSAMD8的小发夹RNA(shRNA)(命名为sh-circ-SAMD8), 并设计了sh-circ-SAMD8的乱序序列作为阴性对照(命名为sh-NC)。shRNA序列见表 2。然后，通过Bbs I和BamH I限制位点，将sh-circ-SAMD8和sh-NC克隆到表达新霉素抗性和绿色荧光蛋白(GFP)的pGPH1载体中(GenePharma, Shanghai, China)。这些重组质粒分别转化到大肠杆菌DH5α细胞中，然后使用商业试剂盒(Tiangen Biotech, Beijing, China)提取。
表 2 shRNA序列名称 序列(5′-3′) sh-circ-SAMD8 上游序列 CACCGGAATCACATTGCTAACATTGCGAACAATGTTAGCAATGTGATTCC 下游序列 AAAAGGAATCACATTGCTAACATTGTTCGCAATGTTAGCAATGTGATTCC sh-NC 上游序列 CACCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG 下游序列 GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA 1.7 细胞转染
PcDNA3.1空载体、携带circ-SAMD8的pcDNA3.1质粒(p-circ-SAMD8)或RHOB的质粒(p-RHOB)、miR-223-3p模拟物和miRNA对照(miR-NC)均从BGI(中国深圳)获得。本研究组织共分为6组: NC组、p-circ-SAMD8组、sh-circ-SAMD8组、miR-223-3p mimics组、p-RHOB+miR-223-3p mimics组、p-RHOB组。转染前，处于对数生长期的CFPAC-1和PANC-1细胞经胰酶消化，重新悬浮于完全培养基，并接种到6孔板中(每孔1×106个细胞)。在37 ℃孵育18~24 h后，细胞密度达到80%~90%的融合率后，将细胞原培养基更换为不含胎牛血清和抗生素的基础培养基。3 h后，质粒、miR-223-3p模拟物和miR-NC分别通过脂质体2000(Invitrogen)包装，并转染到CFPAC-1和PANC-1细胞中，在37 ℃, 5% CO2条件下继续培养48 h。
1.8 双荧光素酶报告试验
利用生物信息学分析预测了circ-SAMD8的靶向miRNA(miR-223-3p)和下游mRNA(RHOB)。采用Sangon-Biotech(中国深圳)合成的野生型(wt)和突变型(mut)circ-SAMD8、RHOB 3′-UTR序列，然后克隆到psiCHECKTM-2质粒(Promega, Madison, WI, USA)中。将HEK293细胞接种到24孔板中，每孔1×105个细胞，然后将携带circ-SAMD8的质粒和Renilla荧光素质粒(pRL-SV40)与miR-223-3p模拟物或miR-NC共转染到细胞中。转染48 h后，去除培养基，洗涤细胞，裂解。收集裂解物，以12 000转/min离心2 min。使用双荧光素酶报告试验系统(Promega)测量上清液中2种荧光素的强度。
1.9 MTT试验
PDAC细胞被收获、胰酶化后，在含有10% 胎牛血清(FBS)的培养基中重新悬浮。取200 μL单细胞悬浮液加入96孔板中(每孔1 000个细胞)。在0、24、48、72 h, 向培养基中加入10 μL的MTT试剂[5 mg磷酸盐缓冲液(PBS), pH值=7.4], 在37 ℃孵育4 h。小心地去除上清液，加入100 μL DMSO至每个孔。在37 ℃孵育10 min后，测定490 nm处的光密度值。
1.10 细胞集落形成实验
将制备好的PDAC细胞单细胞悬浮液培养在含有5% CO2的37 ℃培养箱中的6孔板中(每孔1×103个细胞)。孵育1~2周，此期间细胞集落清晰可见，去除培养基，冷PBS洗涤细胞, 4%戊二醛固定15 min, GIMSA染液染色10~30 min。使用Leica显微镜(Leica, Wetzlar, Germany)计数集落数目。
1.11 流式细胞术分析
转染48 h后，收取细胞，洗涤，按照Annexin V-Propidium Iodide(PI)凋亡试剂盒(Invitrogen)说明书进行操作。通过CyAn ADP流式细胞仪检测凋亡细胞情况。
1.12 免疫印迹法(Western blot)
使用RAPI缓冲液(Tiangen Biotech)裂解组织和细胞，使用以下一抗: 兔抗-RHOB(1∶1 000, ab155149, Abcam, 种属特异性为小鼠、大鼠及人源)，抗-GAPDH(1∶2 000, sc-47724, Santa Cruz, 种属特异性为小鼠、大鼠及人源)，抗-Bax(1∶1 000, ab32503, Abcam, 种属特异性为小鼠、大鼠及人源)和抗-Bcl-2(1∶500, ab32124, Abcam, 种属特异性为小鼠、大鼠及人源)。最后，使用UVP GelDoc-It 310成像系统(UVP, Cambirdge, UK)拍摄图像，并计算每个条带的强度。GAPDH蛋白作为内参对照。
1.13 裸鼠成瘤实验
将转染了p-circ-SAMD8或pcDNA3.1的CFPAC-1细胞在对数生长期收获，并在无血清培养基中以1 mL含1×107个细胞的浓度悬浮。将0.2 mL细胞悬浮液皮下注射到5~8周龄的BALB/c裸鼠(体质量为18~20 g)的背部左侧。在10、13、16、19和25 d时，用游标卡尺测量肿瘤组织的长度(mm)、宽度(mm)和高度(mm), 计算肿瘤体积。在25 d时，收集肿瘤组织进行后续分析。
1.14 统计学分析
所有数据均以均值±标准差表示。本研究使用双侧Student′s t检验进行2组间的比较，使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行多组间的比较，进一步组间两两比较采用Tukey法进行。所有统计学分析均采用Graphpad软件进行操作及分析。每个实验至少重复3次。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 circ-SAMD8的表达在PDAC组织和细胞中下调
采用GPL19978平台分析GSE79634微阵列数据，根据Log2FC>2和P＜0.05的阈值选择差异表达的circRNA, 所有circRNA的表达变化见图 1A。进一步筛选，共得到26个具有显著差异表达的circRNA, 其中circ-SAMD8(hsa_circ_0006148)在PDAC组织中的表达显著较低，见图 1B、图 1C。CFPAC-1和PANC-1细胞中circ-SAMD8的表达低于HPDE6-C7细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图 1D。
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图 1 Circ-SAMD8在PDAC组织和细胞系中表达下调A: 环状RNA表达谱的火山图[X轴: log2(倍数变化); Y轴: -log10(调整后的P值)。垂直的蓝线表示上下2倍，水平的蓝线表示P值为0.05图中的红点和蓝点表示具有统计学意义的差异表达的circRNAs(红色: 上升，蓝色: 下降)]; B: 热图显示PDAC和癌旁组织之间差异表达的circRNAs(n= 26, 差异倍数>4，P＜0.05); C: 采用qRT-PCR检测PDAC组织和癌旁组织中circ-SAMD8的表达水平，与癌旁组织比较, **P＜0.01; D: HPDE6-C7和CFPAC-1、PANC-1中circ-SAMD8的表达水平，与HPDE6-C7比较, **P＜0.01。circ-SAMD8的结构特征通过在线生物信息学应用程序(circBase, http://www.circbase.org/)进行分析。circ-SAMD8的环由线性SAMD8基因的4个外显子组成(图 2A)。在琼脂糖凝胶电泳图(图 2B)上，使用针对circ-SAMD8的发散引物和收敛引物进行的PCR产物，从互补DNA模板中清晰检测到，但使用针对circ-SAMD8的发散引物在基因组DNA中无法放大可见的扩增子。此外，通过RNase R处理和qRT-PCR验证了circ-SAMD8的环状特性。与线性GAPDH相比，在RNase R处理过程中显著降解(P＜0.01); qRT-PCR结果显示, circ-SAMD8的丰度没有受到影响，甚至略有增加(P＞0.05, 图 2C)。在转染p-circ-SAMD8后，受体细胞表现出相应的circ-SAMD8过表达; 相反，转染sh-circ-SAMD8导致PDAC受体细胞中circ-SAMD8的显著下调(P＜0.01, 图 2D、图 2E)。
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图 2 circ-SAMD8的环状鉴定A: 由SAMD8基因产生的circ-SAMD8的示意图; B: 不同的引物在互补DNA中检测到环状RNA, 但未在基因组DNA中检测到; C: qRT-PCR证明, circ-SAMD8未能被RNase R处理消化, 与Mock(对照)比较, **P＜0.01; D: circ-SAMD8、Mock、sh-circ和sh-NC载体的结构图; E: qRT-PCR检测p-circ-SAMD8和si-circ-SAMD8在PDAC细胞中的转染效率, 与NC比较, **P＜0.01。2.2 circ-SAMD8抑制PDAC细胞增殖
通过MTT实验检测了circ-SAMD8对PDAC细胞存活率的影响(图 3A、图 3B)。circ-SAMD8的过表达显著抑制了CFPAC-1和PANC-1细胞存活率，而circ-SAMD8的下调显著促进了PDAC细胞存活率(P＜0.01)。此外，这个结果通过克隆形成实验进行了验证(图 3C), 结果显示, circ-SAMD8的过表达显著抑制了PDAC细胞的增殖能力，而这种抑制可以通过circ-SAMD8的沉默增强(P＜0.01, 图 3D)。
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图 3 Circ-SAMD8抑制PDAC细胞增殖A、B: MTT试验显示，过表达circ-SAMD8抑制了PDAC细胞的增殖; C、D: 集落形成生长试验，集落被染色、捕捉和计数。与NC比较, **P＜0.01。通过Western blot检测了CFPAC-1(图 4A)和PANC-1(图 4B)细胞中与凋亡相关的蛋白Bcl-2和Bax的表达水平。结果显示, circ-SAMD8的过表达显著抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并促进促凋亡蛋白Bax的表达。而circ-SAMD8的沉默显著增加Bcl-2的表达水平，并导致Bax下调。通过流式细胞术检测了凋亡细胞(图 4C), 转染p-circ-SAMD8的PDAC细胞的凋亡率显著高于转染无载体质粒的细胞。相反，转染sh-cric-SAMD8可以显著降低CFPAC-1和PANC-1细胞的凋亡率(P＜0.01, 图 4C和4D)。
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图 4 Circ-SAMD8促进PDAC细胞凋亡A、B: Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达水平; C、D: Annexin V/propidium iodide染色测量凋亡, 通过流式细胞术评估包括早期(右下角)和晚期凋亡细胞(右上角)的细胞百分比。与NC比较, **P＜0.01。2.3 circ-SAMD8抑制裸鼠中PDAC肿瘤的生长
分别将转染有p-circ-SAMD8或空质粒的CFPAC1细胞皮下植入裸鼠体内。在植入10 d时，所有小鼠体内植入的肿瘤大小相同，随后肿瘤在体内逐渐生长，但在circ-SAMD8过表达的裸鼠中，肿瘤的增长速率慢于正常裸鼠，差异有统计学意义(P＜0.01, 图 5A)。circ-SAMD8的过表达显著抑制了裸鼠体内皮下移植肿瘤的生长，肿瘤组织的质量显著降低(P＜0.01, 图 5B、图 5C)。qRT-PCR结果显示，转染有p-circ-SAMD8的CFPAC1细胞植入裸鼠后，裸鼠体内的circ-SAMD8表达显著上调(P＜0.01，图 5D)。
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图 5 过表达circ-SAMD8显著抑制胰腺肿瘤体内生长A: 裸鼠PDAC肿瘤生长情况; B: 裸鼠中由p-circ-SAMD8或空质粒转染细胞获得的肿瘤, 比例尺为15 mm; C: 裸鼠中移植肿瘤的质量，于植入后25 d取出肿瘤组织; D: qRT-PCR检测肿瘤组织中circ-SAMD8的表达水平。与NC比较, **P＜0.01。2.4 miR-223-3p与circ-SAMD8之间的靶向关系
生物信息学分析结果(starBase, http://starbase.sysu.edu.cn/) 显示circ-SAMD8可以直接结合miR-223-3p(图 6A)。双荧光素酶报告基因实验显示，在共转染miR-223-3p mimics和miR-NC的细胞中，含有circ-SAMD8-wt的荧光素酶报告基因的相对活性受到抑制(P＜0.01, 图 6B)。在PDAC组织中, miR-223-3p的表达高于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.01, 图 6C)。此外，与HPDE6-C7细胞相比, CFPAC-1和PANC-1细胞中miR-223-3p的表达也上调(P＜0.01, 图 6D)。过表达circ-SAMD8的CFPAC1细胞能够显著抑制miR-223-3p的表达，而其低表达促进miR-223-3p的表达显著增加(P＜0.01, 图 6E)。miR-223-3p的激活或抑制都无法对circ-SAMD8的表达产生显著影响(P＞0.05, 图 6F)。
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图 6 miR-223-3p与circ-SAMD8的靶向关系A: 预测miR-223-3p和circ-SAMD8的结合位点; B: 双荧光素酶报告基因实验, 与NC比较, **P＜0.01; C: qRT-PCR检测PDAC组织和癌旁组织中miR-223-3p的表达水平, 与癌旁组织相比, **P＜0.01; D: qRT-PCR检测PDAC细胞和正常胰腺导管上皮细胞中miR-223-3p的表达水平, 与HPDE6-C7相比, **P＜0.01; E: MiR-223-3p受circ-SAMD8的负调控, 与NC相比, **P＜0.01; F: 在miR-223-3p过表达或低表达的CFPAC-1细胞中, circ-SAMD8的相对表达量。2.5 PDAC组织和细胞中RHOB的表达特征
miR-223-3p的下游靶向mRNA通过在线miRecode(http://www.mircode.org/)进行预测的, RHOB为最佳靶向(图 7A)。双荧光素酶报告试验分析显示, RHOB含有2个miR-223-3p的结合位点, miR-223-3p模拟物能够通过结合到野生型RHOB中的靶向位点显著抑制荧光素酶的活性，但对突变型RHOB没有影响(图 7B、图 7C)。在PDAC组织中, RHOB mRNA的表达低于癌旁组织，差异有统计学意义(P＜0.01, 图 7D)。与HPDE6-C7相比, CFPAC-1和PANC-1细胞中的RHOB mRNA表达降低，差异有统计学意义(P＜0.01, 图 7E)。Western blot结果显示, circ-SAMD8下调和miR-223-3p过表达均能显著抑制RHOB蛋白的表达(P＜0.01, 图 7F)。
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图 7 miR-223-3p靶基因RHOB在PDAC中的表达A: 预测miR-223-3p在RHOB 3′UTR上的结合位点; B、C: 双荧光素酶报告试验; 与NC比较, **P＜0.01; D: qRT-PCR检测PDAC组织和癌旁组织中RHOB的表达水平, 与癌旁组织比较, **P＜0.01; E: 检测HPDE6-C7和CFPAC-1、PANC-1中RHOB的表达水平, 与HPDE6-C7比较, **P＜0.01; F: Western blot检测miR-223-3p和RHOB之间的调节效应, 与NC比较, **P＜0.01。2.6 miR-223-3p抑制RHOB的激活促进PDAC细胞增殖
CFPAC-1和PANC-1细胞分别转染miR-NC、p-RHOB、miR-223-3p模拟物、p-RHOB+miR-223-3p模拟物，并分为相应的组: NC组、p-RHOB组、miR-223-3p模拟物组和p-RHOB+miR-223-3p模拟物组。与NC组相比, p-RHOB组中RHOB的表达增加, miR-223-3p模拟物组降低，差异有统计学意义(P＜0.01, 见图 8A)。miR-223-3p模拟物组中, miR-223-3p的水平升高, 在p-RHOB组中水平降低，差异有统计学意义(P＜0.01, 图 8B)。MTT实验结果显示，过表达miR-223-3p显著增强PDAC细胞存活率，而过表达RHOB则显著抑制PDAC细胞的存活率(P＜0.01, 图 8C、图 8D)。克隆形成实验显示, miR-223-3p模拟物转染显著增强PDAC细胞的增殖能力, p-RHOB转染显著抑制这种增殖能力(P＜0.01, 图 8E、图 8F)。
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图 8 miR-223-3p和RHOB对PDAC细胞增殖的影响A: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后, CFPAC-1和PANC-1细胞中RHOB mRNA的表达水平, 与NC比较, **P＜0.01; B: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后, CFPAC-1和PANC-1细胞中miR-223-3p的表达水平, 与NC比较, **P＜0.01; C、D: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后, PDAC细胞的存活率, 两者比较, **P＜0.01; E、F: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后，PDAC细胞的增殖能力, 将细胞克隆染色、捕获并计数, 与NC比较, **P＜0.01。3. 讨论
本研究发现, PDAC组织中circ-SAMD8异常低表达，进一步研究表明, circ-SAMD8可能在PDAC中起到肿瘤抑制因子作用, circ-SAMD8过表达显著抑制了PDAC细胞的存活能力和增殖能力，并促进了细胞凋亡。本研究建立肿瘤异种移植模型实验证实, circ-SAMD8的过表达抑制了裸鼠的肿瘤生长。此外，在PDAC细胞中观察到miR-223-3p与circ-SAMD8之间存在明显关系, circ-SAMD8通过靶向调节调控了miR-223-3p及其下游靶向基因RHOB的表达，这对PDAC细胞增殖和凋亡过程产生了影响。
研究[8]显示, circRNA在细胞周期进程等重要生物功能中起关键作用。胃癌筛查中使用circRNA作为生物标志物进行研究，发现has-circ-002059在胃癌组织中下调，并可能成为胃癌诊断和治疗的潜在生物标志物[9]。此外，其他研究[10]表明，一些特定的circRNA在PDAC过程中起重要作用，比如circRNA-100782能够显著调节胰腺癌的增殖。本研究发现，在PDAC细胞中, circ-SAMD8的表达下调。circ-SAMD8的过表达抑制了PDAC细胞增殖，促进了细胞凋亡，并抑制了裸鼠的肿瘤生长。miR-223-3p在多种肿瘤中发挥重要作用。研究[11]证实, miR-223-3p靶向基因SEPT6, 增强前列腺癌的生物行为。此外, miR-223-3p通过靶向SOX11表达，在卵巢癌中调节细胞增殖和侵袭[12]; 在人睾丸生殖细胞肿瘤中通过FBXW7调节细胞生长和凋亡[13]; 通过靶向FOXO3, 调节前列腺癌细胞对化疗的敏感性[14]。但miR-223-3p在PDAC发展中的作用尚不清楚。
本研究探讨了cicr-SAMD8的过表达及其对miR-223-3p的调控作用。本研究结果表明, miR-223-3p在PDAC细胞增殖中起促进作用。为了更好理解miR-223-3p在PDAC过程中的调控机制，本研究考虑了潜在的靶向基因。RHOB是一种参与多种细胞内功能的小GTP酶，对维持人类癌症的恶性表型至关重要[15-16]。本研究发现, miR-223-3p与RHOB之间存在相互作用。本研究在PDAC组织和细胞中观察到miR-223-3p的过表达，且PDAC组织中RHOB mRNA水平显著降低，提示cicr-SAMD8可能通过miR-223-3p调控RHOB。
综上所述，在PDAC组织和细胞中, circ-SAMD8作为一种下调的环状RNA, 通过吸附miR-223-3p并调节其下游RHOB, 抑制PDAC的发生发展。本研究为未来PDAC的靶向治疗提供了新途径。
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图 1 Circ-SAMD8在PDAC组织和细胞系中表达下调
A: 环状RNA表达谱的火山图[X轴: log2(倍数变化); Y轴: -log10(调整后的P值)。垂直的蓝线表示上下2倍，水平的蓝线表示P值为0.05图中的红点和蓝点表示具有统计学意义的差异表达的circRNAs(红色: 上升，蓝色: 下降)]; B: 热图显示PDAC和癌旁组织之间差异表达的circRNAs(n= 26, 差异倍数>4，P＜0.05); C: 采用qRT-PCR检测PDAC组织和癌旁组织中circ-SAMD8的表达水平，与癌旁组织比较, **P＜0.01; D: HPDE6-C7和CFPAC-1、PANC-1中circ-SAMD8的表达水平，与HPDE6-C7比较, **P＜0.01。
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图 2 circ-SAMD8的环状鉴定
A: 由SAMD8基因产生的circ-SAMD8的示意图; B: 不同的引物在互补DNA中检测到环状RNA, 但未在基因组DNA中检测到; C: qRT-PCR证明, circ-SAMD8未能被RNase R处理消化, 与Mock(对照)比较, **P＜0.01; D: circ-SAMD8、Mock、sh-circ和sh-NC载体的结构图; E: qRT-PCR检测p-circ-SAMD8和si-circ-SAMD8在PDAC细胞中的转染效率, 与NC比较, **P＜0.01。
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图 3 Circ-SAMD8抑制PDAC细胞增殖
A、B: MTT试验显示，过表达circ-SAMD8抑制了PDAC细胞的增殖; C、D: 集落形成生长试验，集落被染色、捕捉和计数。与NC比较, **P＜0.01。
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图 4 Circ-SAMD8促进PDAC细胞凋亡
A、B: Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达水平; C、D: Annexin V/propidium iodide染色测量凋亡, 通过流式细胞术评估包括早期(右下角)和晚期凋亡细胞(右上角)的细胞百分比。与NC比较, **P＜0.01。
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图 5 过表达circ-SAMD8显著抑制胰腺肿瘤体内生长
A: 裸鼠PDAC肿瘤生长情况; B: 裸鼠中由p-circ-SAMD8或空质粒转染细胞获得的肿瘤, 比例尺为15 mm; C: 裸鼠中移植肿瘤的质量，于植入后25 d取出肿瘤组织; D: qRT-PCR检测肿瘤组织中circ-SAMD8的表达水平。与NC比较, **P＜0.01。
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图 6 miR-223-3p与circ-SAMD8的靶向关系
A: 预测miR-223-3p和circ-SAMD8的结合位点; B: 双荧光素酶报告基因实验, 与NC比较, **P＜0.01; C: qRT-PCR检测PDAC组织和癌旁组织中miR-223-3p的表达水平, 与癌旁组织相比, **P＜0.01; D: qRT-PCR检测PDAC细胞和正常胰腺导管上皮细胞中miR-223-3p的表达水平, 与HPDE6-C7相比, **P＜0.01; E: MiR-223-3p受circ-SAMD8的负调控, 与NC相比, **P＜0.01; F: 在miR-223-3p过表达或低表达的CFPAC-1细胞中, circ-SAMD8的相对表达量。
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图 7 miR-223-3p靶基因RHOB在PDAC中的表达
A: 预测miR-223-3p在RHOB 3′UTR上的结合位点; B、C: 双荧光素酶报告试验; 与NC比较, **P＜0.01; D: qRT-PCR检测PDAC组织和癌旁组织中RHOB的表达水平, 与癌旁组织比较, **P＜0.01; E: 检测HPDE6-C7和CFPAC-1、PANC-1中RHOB的表达水平, 与HPDE6-C7比较, **P＜0.01; F: Western blot检测miR-223-3p和RHOB之间的调节效应, 与NC比较, **P＜0.01。
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图 8 miR-223-3p和RHOB对PDAC细胞增殖的影响
A: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后, CFPAC-1和PANC-1细胞中RHOB mRNA的表达水平, 与NC比较, **P＜0.01; B: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后, CFPAC-1和PANC-1细胞中miR-223-3p的表达水平, 与NC比较, **P＜0.01; C、D: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后, PDAC细胞的存活率, 两者比较, **P＜0.01; E、F: 转染p-RHOB和miR-223-3p mimics后，PDAC细胞的增殖能力, 将细胞克隆染色、捕获并计数, 与NC比较, **P＜0.01。
表 1 引物序列
基因名称 引物 引物序列 miR-223-3p 上游引物 5′-CGTCCTGTCAGTTTGTCAAAT-3′ 下游引物 5′-AACTGACACTCTACCACATGGA-3′ circ-SAMD8 上游引物 5′-GCGGTTCACAGTGGCTAAGTTC-3′ 下游引物 5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′ SAMD8 上游引物 5′-GTGGACGCTCTTCAGTTCCT-3' 下游引物 5′-CGTCCACACCGCCACTT-3′ RHOB 上游引物 5′-GAAGGAACGGAATCGCAACAA-3′ 下游引物 5′-TGGCATAGGCAGGAAGAAGAG-3′ U6 上游引物 5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3′ 下游引物 5′-AACGATTCACGAATTTGCGT-3′ GAPDH 上游引物 5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′ 下游引物 5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′ 
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表 2 shRNA序列
名称 序列(5′-3′) sh-circ-SAMD8 上游序列 CACCGGAATCACATTGCTAACATTGCGAACAATGTTAGCAATGTGATTCC 下游序列 AAAAGGAATCACATTGCTAACATTGTTCGCAATGTTAGCAATGTGATTCC sh-NC 上游序列 CACCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG 下游序列 GATCCAAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA
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[1] 潘泓, 廖颖娜, 盖严支, 等. 分选链接蛋白1在胰腺导管腺癌中的表达及其促进胰腺导管腺癌进展的机制研究[J]. 上海交通大学学报: 医学版, 2023, 43(3): 278-292. doi: 10.3969/j.issn.1674-8115.2023.03.003 [2] ZHENG L, XUE J, JAFFEE E M, et al. Role of immune cells and immune-based therapies in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Gastroenterology, 2013, 144(6): 1230-1240. doi: 10.1053/j.gastro.2012.12.042
[3] GIFFORD J B, HUANG W, ZELENIAK A E, et al. Expression of GRP78, master regulator of the unfolded protein response, increases chemoresistance in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Mol Cancer Ther, 2016, 15(5): 1043-1052. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-15-0774
[4] 钱心怡, 刘鹏渊, 陆燕. 非编码RNA在肿瘤发生发展和诊治中的作用[J]. 中国科学: 生命科学, 2022, 52(12): 1796-1806. [5] HAN D, LI J X, WANG H M, et al. Circular RNA circMTO1 acts as the sponge of microRNA-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression[J]. Hepatology, 2017, 66(4): 1151-1164. doi: 10.1002/hep.29270
[6] BHASKARAN M, MOHAN M. MicroRNAs: history, biogenesis, and their evolving role in animal development and disease[J]. Vet Pathol, 2014, 51(4): 759-774. doi: 10.1177/0300985813502820
[7] SHEN F, CAI W S, FENG Z, et al. MiR-492 contributes to cell proliferation and cell cycle of human breast cancer cells by suppressing SOX7 expression[J]. Tumour Biol, 2015, 36(3): 1913-1921. doi: 10.1007/s13277-014-2794-z
[8] FRAMPTON A E, GIOVANNETTI E, JAMIESON N B, et al. A microRNA meta-signature for pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2014, 14(3): 267-271. doi: 10.1586/14737159.2014.893192
[9] DU W W, YANG W N, LIU E, et al. Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2[J]. Nucleic Acids es, 2016, 44(6): 2846-2858. doi: 10.1093/nar/gkw027
[10] BACHMAYR-HEYDA A, REINER A T, AUER K, et al. Correlation of circular RNA abundance with proliferation: exemplified with colorectal and ovarian cancer, idiopathic lung fibrosis, and normal human tissues[J]. Sci Rep, 2015, 5: 8057. doi: 10.1038/srep08057
[11] LI P F, CHEN S C, CHEN H L, et al. Using circular RNA as a novel type of biomarker in the screening of gastric cancer[J]. Clin Chim Acta, 2015, 444: 132-136. doi: 10.1016/j.cca.2015.02.018
[12] CHEN G W, SHI Y T, ZHANG Y, et al. CircRNA_100782 regulates pancreatic carcinoma proliferation through the IL6-STAT3 pathway[J]. Onco Targets Ther, 2017, 10: 5783-5794. doi: 10.2147/OTT.S150678
[13] HUANG W J, WANG Y C, LIU S S, et al. Silencing circular RNA hsa_circ_0000977 suppresses pancreatic ductal adenocarcinoma progression by stimulating miR-874-3p and inhibiting PLK1 expression[J]. Cancer Lett, 2018, 422: 70-80. doi: 10.1016/j.canlet.2018.02.014
[14] WEI Y B, YANG J R, YI L, et al. MiR-223-3p targeting SEPT6 promotes the biological behavior of prostate cancer[J]. Sci Rep, 2014, 4: 7546. doi: 10.1038/srep07546
[15] LIU J K, SHI H, LI X D, et al. MiR-223-3p regulates cell growth and apoptosis via FBXW7 suggesting an oncogenic role in human testicular germ cell tumors[J]. Int J Oncol, 2017, 50(2): 356-364. doi: 10.3892/ijo.2016.3807
[16] FENG Q, HE P, WANG Y. MicroRNA-223-3p regulates cell chemo-sensitivity by targeting FOXO3 in prostatic cancer[J]. Gene, 2018, 658: 152-158. doi: 10.1016/j.gene.2018.03.013
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