Clinical investigation in abundance of Fusobacterium nucleatum in tumor tissues as a prognostic biomarker for stage Ⅱ colorectal cancer
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摘要:目的
评估肿瘤组织中具核梭杆菌(Fn)丰度对Ⅱ期结直肠癌(CRC)患者预后的影响。
方法收集2013年1月—2018年12月151例在扬州大学附属医院接受手术治疗的Ⅱ期CRC患者的肿瘤标本，通过定量聚合酶链反应检测肿瘤组织中Fn的基因相对表达水平，并通过中位数法将其分为Fn高丰度组和Fn低丰度组。采用卡方检验分析Fn丰度与临床特征的相关性。采用Kaplan-Meier生存曲线分析Fn丰度对患者肿瘤特异性生存期(CSS)和无病生存期(DFS)的影响。基于Cox风险比例回归模型的单因素和多因素明确Fn丰度是否为预后的独立影响因素。
结果Fn丰度与Ⅱ期CRC患者临床特征均无显著相关性(P>0.05)。Ⅱ期CRC患者中, Fn丰度与患者的CSS及DFS呈负相关(P=0.01)。单因素及多因素分析结果表明, Fn丰度为影响Ⅱ期CRC患者CSS及DFS的独立影响因素(P < 0.05)。亚组分析结果表明, Fn丰度与Ⅱ期低危患者的CSS及DFS无显著相关性(P=0.22、0.47), 但与高危患者的CSS及DFS呈负相关(P < 0.01)。单因素及多因素分析结果表明, Fn丰度为Ⅱ期高危CRC患者CSS及DFS的独立影响因素。
结论肿瘤组织中Fn丰度为Ⅱ期高危CRC患者预后不良的独立影响因素，靶向Fn有望成为防治CRC术后复发转移的新策略。
Abstract:ObjectiveTo evaluate the prognostic impact of abundance of Fusobacterium nucleatum (Fn) in the tumor tissues in stage Ⅱ colorectal cancer (CRC) patients.
MethodsTumor specimen of 151 CRC stage Ⅱ patients receiving surgical treatment at Affiliated Hospital of Yangzhou University between January 2013 and December 2018 were collected. The relative levels of Fn gene in the CRC tissues were detected using quantitative real-time polymerase chain reaction, and were divided into highFn level group and low Fn abundance group using the median method. The chi-square test was used to analyze the correlation between Fn abundance and clinical features. The Kaplan-Meier survival analysis was used to clarify the impacts of Fn abundance on the cancer-specific survival (CSS) and disease-free survival (DFS) of the patients. The univariate and multivariate analysis based on the Cox proportional hazard model was used to identify whether Fn abundance was an independent prognostic factor.
ResultsNo significant correlation was observed between Fn abundance in the CRC tissues and any of clinical features (P>0.05). In the stage Ⅱ CRC patients, Fn abundance was negatively correlated with the CSS and DFS (P=0.01). The univariate and multivariate analysis revealed Fn abundance was an independent unfavorable factor affecting CSS and DFS (P < 0.05). Subgroup analysis showed that Fn abundance had no relation with the CSS or DFS of low-risk stage Ⅱ patients (P=0.22, 0.47), but was negatively correlated with that of high-risk stage Ⅱ patients (P < 0.01). The univariate and multivariate analysis revealed Fn abundance was an independent factor affecting CSS and DFS in the high-risk stage Ⅱ CRC patients.
ConclusionFn abundance in the CRC tissues is identified as an independent influencing factor for high-risk stage Ⅱ CRC patients. Targeting Fn may be a novel strategy to the prevent postoperative recurrence and progression of CRC.
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Keywords:
- Fusobacterium nucleatum /
- abundance /
- colorectal cancer /
- prognosis /
- recurrence /
- metastasis /
- chemotherapy /
- biomarker
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结直肠癌(CRC)作为常见消化系统恶性肿瘤，近10年来在中国发病率逐年增高[1]。研究[2]表明，肠道菌群可作为CRC诊断及治疗的潜在标志物。具核梭杆菌(Fn)作为口腔来源的厌氧菌，在CRC的发生发展中扮演重要角色[3]。本课题组前期通过宏基因组测序发现, Fn在CRC患者肠道中丰度显著高于健康人群，且Fn可通过促进CRC细胞代谢产生环氧十八碳烯酸介导上皮-间质转化(EMT)[4]。在临床研究[5]中, Fn丰度与CRC患者的总生存期(OS)、无病生存期(DFS)及肿瘤特异性生存期(CSS)呈显著负相关。尽管Ⅱ期CRC术前不伴有淋巴结及远处转移，但是仍有相当一部分患者术后易发生复发或转移，因而寻找可靠预后标志物对于改善Ⅱ期CRC患者的总体预后显得尤为重要[6]。本研究通过回顾性研究明确Fn丰度对Ⅱ期CRC患者预后的影响，为肠道菌群标志物在CRC诊疗中的应用提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
收集2013年1月—2018年12月在扬州大学附属医院手术切除的CRC样本及匹配的临床信息。临床信息包括性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、清扫淋巴结数目、神经侵犯、组织分化程度、肿瘤最大直径、粪便隐血(OB)试验结果、血清癌胚抗原(CEA)、肿瘤组织Ki-67表达水平及随访资料。纳入标准: ①未进行术前新辅助化疗或放疗者; ②符合美国癌症分期联合委员会(AJCC)第8版术后病理TNM分期为Ⅱ期的CRC者; ③临床资料完整者; ④知情同意使用临床样本及资料者。排除标准: ①伴有其他未治愈的原发恶性肿瘤者; ②术后因感染、心血管疾病或其他非肿瘤原因死亡的患者; ③术前半年行抗生素治疗者。本研究已经通过扬州大学附属医院伦理委员会审批。
1.2 主要试剂和仪器
组织DNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司，实时荧光定量试剂盒(SYBR Premix Ex Taq)购自日本TAKARA公司。Fn的基因及内参β-actin引物购自上海生工生物工程公司, Fn的基因引物上游: 5′-AAGCGCGTCT AGGTGGTTATGT-3′, 下游: 5′-TGTAGTTCCGCTTACCTCTCCAG-3′; β-actin基因引物上游: 5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′, 下游: 5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。荧光定量聚合酶链反应分析仪购自美国应用生物系统公司。
1.3 定量聚合酶链反应
根据DNA提取试剂盒说明书配置缓冲液buffer ATL、buffer AL、buffer AW1及buffer AW2。将组织样本加入buffer ATL和磷酸盐缓冲液(PBS)混合溶液中研磨，随后加入蛋白酶K并充分振荡。将样本置于水浴锅中至组织完全裂解，加入RNase A去除残存RNA, 加入buffer AL和无水酒精充分混匀。将样本置于离心管中，加入buffer AW2溶液，室温离心3 min(12 000 g)。采用紫外分光光度计检测DNA质量及浓度。聚合酶链反应扩增体系配置如下: SYBR Premix Ex Taq溶液(10.0 μL), 上游及下游引物(均0.4 μL), DNA模板(2.0 μL), 加入无RNA酶的水至总体积为20 μL。聚合酶链反应条件如下: 95 ℃预变性10 min, 95 ℃变性1 min, 60 ℃退火20 s, 56 ℃延伸60 s, 共40个循环。以内参基因β-actin作为对照，根据Ct值进行数据分析，通过2-△△Ct方法计算Fn的基因相对表达量，根据中位数法确定Fn高丰度组和Fn低丰度组。
1.4 评价指标
该研究起点为患者手术日期，终点为疾病进展日期、因CRC死亡日期或最后一次随访日期，最终评价指标包括CSS和DFS。CSS定义为手术日期至因肿瘤死亡或随访截止日期，DFS定义为手术日期至肿瘤进展日期。
1.5 统计学方法
采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。Fn丰度与患者临床病理特征关系采用χ2检验，采用Kaplan-Meier法在GraphPad Prism 8软件上绘制生存曲线并进行Log-rank生存检验。通过单因素及多因素Cox风险比例回归模型分析Fn丰度与CRC患者CSS及DFS的关系, P < 0.05(双侧)为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 肿瘤组织中Fn丰度与Ⅱ期CRC患者临床特征的相关性
151例Ⅱ期CRC患者中，肿瘤组织Fn高丰度组及Fn低丰度组分别包括76、75例患者。Fn丰度与性别(P=0.57)、年龄(P=0.16)、肿瘤部位(P=0.89)、T分期(P=0.94)、肿瘤直径(P=0.92)、清扫淋巴结数目(P=0.54)、神经/血管侵犯(P=0.17)、组织分化(P=0.74)、OB试验结果(P=0.37)、血清CEA水平(P=0.57)及Ki-67表达(P=0.95)均无显著相关性。见表 1。
表 1 Fn丰度与Ⅱ期CRC患者临床病理特征的相关性[n(%)]临床特征 分类 总例数(n=151) Fn低丰度组(n=75) Fn高丰度组(n=76) χ2 P 性别 女 74 35(46.67) 39(51.32) 0.33 0.57 男 77 40(53.33) 37(48.68) 年龄 ≤60岁 35 21(28.00) 14(18.42) 1.95 0.16 > 60岁 116 54(72.00) 62(81.58) 肿瘤部位 结肠 112 56(74.67) 56(73.68) 0.02 0.89 直肠 39 19(25.33) 20(26.32) T分期 T3期 81 40(53.33) 41(53.95) 0.01 0.94 T4期 70 35(46.67) 35(46.05) 肿瘤直径 ≤5 cm 94 47(62.67) 47(61.84) 0.01 0.92 > 5 cm 57 28(37.33) 29(38.16) 淋巴结数目 ≥12枚 126 64(85.33) 62(81.58) 0.39 0.54 < 12枚 25 11(14.67) 14(18.42) 神经/血管侵犯 无 120 63(84.00) 57(75.00) 1.87 0.17 有 31 12(16.00) 19(25.00) 组织分化 高/中 115 58(77.33) 57(75.00) 0.11 0.74 低 36 17(22.67) 19(25.00) OB试验 阴性 70 32(42.67) 38(50.00) 0.82 0.37 阳性 81 43(57.33) 38(50.00) CEA ≤5 ng/mL 80 38(50.67) 42(55.26) 0.32 0.57 > 5 ng/mL 71 37(49.33) 34(44.74) Ki-67 < 30% 97 48(64.00) 49(64.47) 0.01 0.95 ≥30% 54 27(36.00) 27(35.53) OB: 隐血; CEA: 癌胚抗原。 2.2 肿瘤组织中Fn丰度对Ⅱ期CRC患者CSS及DFS的影响
151例Ⅱ期CRC患者中，生存分析曲线表明, Fn高丰度组较Fn低丰度组CSS和DFS更短，差异有统计学意义(P < 0.01)。见图 1。单因素COX回归分析表明，清扫淋巴结数目、神经侵犯、组织分化及Fn丰度与Ⅱ期CRC患者CSS显著相关(P < 0.05), 而与性别、年龄、肿瘤部位、T分期、肿瘤直径、OB试验结果、CEA水平及Ki-67表达均无相关性(P > 0.05)。多因素COX回归分析表明，清扫淋巴结数目xy 12枚、神经/血管侵犯、低分化及Fn高丰度是影响患者CSS的独立预后不良因素。见表 2。单因素分析表明, Ⅱ期CRC患者DFS与清扫淋巴结数目、神经侵犯、组织分化及Fn丰度显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、T分期、肿瘤直径、OB试验结果、CEA水平及Ki-67表达均无显著相关性。多因素分析表明，清扫淋巴结数目 < 12枚、神经/血管侵犯、低分化及Fn高丰度是影响Ⅱ期CRC患者DFS的独立危险因素。见表 3。
表 2 Ⅱ期CRC患者CSS的单因素及多因素分析变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.34 0.75~2.38 0.33 — — — 年龄 1.77 0.79~3.96 0.16 — — — 肿瘤部位 1.18 0.63~2.20 0.61 — — — T分期 1.74 0.98~3.10 0.06 — — — 肿瘤直径 1.20 0.67~2.15 0.54 — — — OB试验 1.49 0.83~2.68 0.19 — — — CEA 0.98 0.55~1.74 0.94 — — — Ki-67 0.63 0.33~1.19 0.15 — — — 清扫淋巴数目 2.46 1.32~4.61 0.01 3.41 1.78~6.54 < 0.01 神经/血管侵犯 3.16 1.72~5.83 < 0.01 3.04 1.58~5.88 < 0.01 组织分化 2.45 1.34~4.45 < 0.01 2.16 1.15~4.06 0.02 Fn丰度 2.20 1.20~4.02 0.01 2.19 1.19~4.02 0.01 表 3 Ⅱ期CRC患者DFS的单因素及多因素分析变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.69 0.99~2.86 0.05 — — — 年龄 1.77 0.87~3.61 0.12 — — — 肿瘤部位 1.49 0.87~2.56 0.15 — — — T分期 1.42 0.84~2.37 0.19 — — — 肿瘤直径 1.19 0.70~2.02 0.52 — — — OB试验 1.43 0.84~2.42 0.19 — — — CEA 1.02 0.61~1.71 0.94 — — — Ki-67 0.72 0.41~1.26 0.25 — — — 清扫淋巴数目 2.21 1.24~3.93 < 0.01 2.87 1.58~5.21 < 0.01 神经/血管侵犯 2.43 1.36~4.35 < 0.01 2.36 1.27~4.39 < 0.01 组织分化 2.23 1.28~3.88 < 0.01 2.04 1.15~3.64 0.02 Fn丰度 2.03 1.19~3.48 < 0.01 2.00 1.17~3.43 0.01 2.3 亚组分析
将Ⅱ期CRC患者分为高危组(n=114)和低危组(n=37), 其中高危组患者至少含有以下1个高危因素: ① T分期为T4期; ②清扫淋巴结数目 < 12枚; ③伴有血管神经侵犯; ④组织分化为低分化。在Ⅱ期低危组中，生存分析表明，肿瘤组织中Fn丰度与患者的CSS和DFS无显著相关性(P=0.22、P=0.47)。Ⅱ期高危组中，生存分析表明，肿瘤组织中Fn丰度与CRC患者的CSS和DFS呈负相关(P < 0.01)。见图 2。
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图 2 Fn丰度对Ⅱ期低危和高危CRC患者预后的影响A: 低危组Ⅱ期CRC患者的肿瘤特异性生存曲线; B: 低危组Ⅱ期CRC患者的无疾病生存曲线; C: 高危组Ⅱ期CRC患者的肿瘤特异性生存曲线; D: 高危组Ⅱ期CRC患者的无疾病生存曲线。在Ⅱ期高危组CRC患者中，单因素分析表明，清扫淋巴结数目、神经侵犯、组织分化及Fn丰度与患者CSS显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、T分期、肿瘤直径、OB试验结果、CEA水平及Ki-67表达均无相关性。多因素分析结果表明，清扫淋巴结数目、神经侵犯、组织分化及Fn丰度是影响患者CSS的独立不良预后因素。见表 4。单因素分析表明，高危组Ⅱ期CRC患者DFS与清扫淋巴结数目、神经侵犯、组织分化及Fn丰度显著相关，而与性别、年龄、肿瘤部位、T分期、肿瘤直径、OB试验结果、CEA水平及Ki-67表达均无相关性。多因素分析结果表明，清扫淋巴结数目 < 12枚、神经/血管侵犯、低分化及Fn高丰度是影响高危组Ⅱ期CRC患者DFS的独立不良预后因素。见表 5。
表 4 高危组Ⅱ期CRC患者CSS的单因素及多因素分析变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.33 0.71~2.47 0.37 — — — 年龄 1.68 0.71~3.99 0.24 — — — 肿瘤部位 1.09 0.57~2.11 0.79 — — — T分期 1.18 0.63~2.21 0.61 — — — 肿瘤直径 1.13 0.60~2.11 0.71 — — — OB试验 1.14 0.61~2.11 0.69 — — — CEA 1.25 0.68~2.31 0.48 — — — Ki-67 0.94 0.48~1.81 0.84 — — — 清扫淋巴数目 1.95 1.02~3.73 0.04 3.19 1.57~6.45 < 0.01 神经/血管侵犯 2.47 1.31~4.66 < 0.01 2.81 1.42~5.56 < 0.01 组织分化 1.89 1.01~3.52 0.04 2.04 1.06~3.92 0.03 Fn丰度 2.31 1.21~4.42 0.01 2.20 1.15~4.22 0.02 表 5 高危组Ⅱ期CRC患者DFS的单因素及多因素分析变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.48 0.83~2.64 0.18 — — — 年龄 1.81 0.81~4.05 0.15 — — — 肿瘤部位 1.28 0.71~2.31 0.41 — — — T分期 1.04 0.58~1.84 0.91 — — — 肿瘤直径 1.08 0.60~1.94 0.80 — — — OB试验 1.11 0.63~1.98 0.71 — — — CEA 1.59 0.90~2.80 0.11 — — — Ki-67 1.00 0.55~1.82 0.99 — — — 清扫淋巴数目 1.86 1.02~3.40 0.04 2.81 1.46~5.40 < 0.01 神经/血管侵犯 1.99 1.09~3.65 0.03 2.24 1.17~4.30 0.02 组织分化 1.84 1.03~3.29 0.04 1.99 1.08~3.65 0.03 Fn丰度 2.24 1.23~4.05 0.01 2.13 1.17~3.86 0.01 3. 讨论
CASTELLARIN M等[7]通过RNA测序发现, Fn显著富集于CRC组织，且其丰度与淋巴结转移显著相关。本课题组前期发现Fn丰度与接受化疗的Ⅲ/Ⅳ期CRC患者的预后呈显著负相关，而与EMT及肿瘤干细胞分子表型呈正相关[8]。研究[9]显示, Fn上调CRC细胞中长链非编码RNA表达并介导下游EMT转录因子的翻译，最终促进肿瘤转移。Fn还可以通过促进脂肪酸氧化减少CRC干细胞的脂质积累，进而增强其自我更新能力[10]。Fn通过激活Toll样受体4信号通路调控下游微小RNA-18a/4802表达水平，进而介导CRC细胞发生自噬并对化疗药物产生抵抗[11]。既往研究[12]表明, 15%~25%的Ⅱ期CRC患者会在术后5年内出现疾病复发或因肿瘤死亡，因而亟需寻找可靠生物标志物用于识别术后预后不良的高风险人群。鉴于前期证据表明Fn在CRC恶性进展及耐药中发挥重要作用，本研究拟通过回顾性分析明确其是否可以作为Ⅱ期CRC患者预后评估的生物标志物。
本研究的卡方分析结果表明, Fn丰度与常见临床参数如年龄、性别、肿瘤位置等无显著相关性，上述结果与XIE Y X等[13]最新研究结果一致。在生存分析中, Fn高丰度组患者较Fn低丰度组患者有着更差的CSS和DFS，提示其可能与CRC术后复发转移相关。最后，单因素及多因素分析表明, Fn丰度为Ⅱ期CRC患者预后不良的独立影响因素，提示Fn具有成为预后生物标志物的潜能。一项纳入3 626例CRC患者的循证医学研究[14]表明, Fn高丰度不仅与远处转移、分化程度及微卫星不稳定显著相关，而且提示更差的总生存期(OS)和DFS。然而，也有研究[15]发现, Fn丰度与肿瘤位置相关，但与CRC患者OS无显著相关性。在转移性结肠癌中，尽管Fn在右半结肠的丰度与OS无显著相关性，但是与一线及二线治疗后的无进展生存期(PFS)呈负相关[16]。本研究发现, Fn丰度与CRC患者免疫治疗效果呈正相关，暗示Fn有可能通过改变肿瘤免疫微环境发挥抑癌效应[17]。因此, Fn是否能够成为可靠的CRC预后标志物仍有待于更多的临床研究确认。此外，最新研究[18]发现，唾液Fn丰度与CRC患者的预后显著相关，因此动态检测上述临床样本中Fn丰度是否能够成为监测CRC复发的新非侵袭诊断方法也是未来值得探索的方向。
Ⅱ期CRC高危患者是指伴有T4、肿瘤低分化、血管侵犯等因素的风险人群，但传统临床病理因素并不能充分预测这类患者的预后，进而导致治疗不足或治疗过度[19]。此外，临床研究[20]甚至发现，部分Ⅱ期高危患者的术后生存率显著低于部分Ⅲ期患者，因而寻找可靠预后标志物对于改善Ⅱ期高危患者的总体预后显得尤为关键。本研究亚组分析表明, Fn丰度为Ⅱ期高危CRC患者预后不良的独立影响因素。由于多数Ⅱ期高危CRC患者接受术后辅助化疗，因此推断Fn感染可能导致传统辅助化疗后肿瘤复发或进展。在接受新辅助放化疗的局部进展期直肠癌患者中，肿瘤组织中Fn丰度与肿瘤复发呈正相关[21]。在接受5-Fu为基础的化疗方案的CRC患者中，肿瘤组织中高Fn丰度提示更短的无疾病复发生存时间[22]。在相关机制研究中，Fn感染可介导CRC细胞发生自噬现象，进而增强细胞对化疗药物的抵抗能力[11, 23]。HONG X L等[24]研究发现, Fn感染可通过激活Hedgehog信号通路增强CRC细胞的干性，进而介导化疗抵抗。本研究团队前期通过流式细胞术筛选出CRC干细胞CD133+CD44+亚群，进一步研究发现, Fn感染可通过介导EMT增强上述细胞亚群内外恶性潜能[25]。已知肿瘤干细胞在促进CRC化疗抵抗中扮演着重要角色，因此本研究推断Fn感染也可通过影响CRC干细胞的生物学特性来降低肿瘤对化疗药物的敏感性[26]。
本临床研究存在如下局限性: 首先，受样本量所限, Fn在Ⅱ期及其他分期CRC患者中的临床价值仍待于更多大样本回顾性研究来确证; 其次，本研究聚焦于肿瘤组织中Fn丰度与临床结局的相关性，但粪便中Fn丰度是否与CRC复发进展相关尚未清楚; 再次，能否基于Fn丰度及Ⅱ期高危因素构建优于传统TNM分期体系的新型预后评估模型也是未来值得探索的方向。最后，亟需前瞻性临床试验明确是否能够通过微生态干预手段(如抗生素、益生菌/益生元、粪菌移植等)影响肠道中Fn丰度，进而降低Ⅱ期CRC患者术后复发风险。
综上所述，肿瘤组织中Fn丰度与Ⅱ期CRC患者CSS及DFS呈负相关，并且可作为预后不良的独立影响因素。Fn丰度与Ⅱ期低危患者预后无显著相关性，但是可作为评估Ⅱ期高危患者预后不良的独立影响因素。上述研究成果不仅为Ⅱ期CRC患者预后风险分层提供新的生物标志物，而且进一步推动肠道菌群基础研究成果向肿瘤临床诊疗的转化。
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图 2 Fn丰度对Ⅱ期低危和高危CRC患者预后的影响
A: 低危组Ⅱ期CRC患者的肿瘤特异性生存曲线; B: 低危组Ⅱ期CRC患者的无疾病生存曲线; C: 高危组Ⅱ期CRC患者的肿瘤特异性生存曲线; D: 高危组Ⅱ期CRC患者的无疾病生存曲线。
表 1 Fn丰度与Ⅱ期CRC患者临床病理特征的相关性[n(%)]
临床特征 分类 总例数(n=151) Fn低丰度组(n=75) Fn高丰度组(n=76) χ2 P 性别 女 74 35(46.67) 39(51.32) 0.33 0.57 男 77 40(53.33) 37(48.68) 年龄 ≤60岁 35 21(28.00) 14(18.42) 1.95 0.16 > 60岁 116 54(72.00) 62(81.58) 肿瘤部位 结肠 112 56(74.67) 56(73.68) 0.02 0.89 直肠 39 19(25.33) 20(26.32) T分期 T3期 81 40(53.33) 41(53.95) 0.01 0.94 T4期 70 35(46.67) 35(46.05) 肿瘤直径 ≤5 cm 94 47(62.67) 47(61.84) 0.01 0.92 > 5 cm 57 28(37.33) 29(38.16) 淋巴结数目 ≥12枚 126 64(85.33) 62(81.58) 0.39 0.54 < 12枚 25 11(14.67) 14(18.42) 神经/血管侵犯 无 120 63(84.00) 57(75.00) 1.87 0.17 有 31 12(16.00) 19(25.00) 组织分化 高/中 115 58(77.33) 57(75.00) 0.11 0.74 低 36 17(22.67) 19(25.00) OB试验 阴性 70 32(42.67) 38(50.00) 0.82 0.37 阳性 81 43(57.33) 38(50.00) CEA ≤5 ng/mL 80 38(50.67) 42(55.26) 0.32 0.57 > 5 ng/mL 71 37(49.33) 34(44.74) Ki-67 < 30% 97 48(64.00) 49(64.47) 0.01 0.95 ≥30% 54 27(36.00) 27(35.53) OB: 隐血; CEA: 癌胚抗原。 
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表 2 Ⅱ期CRC患者CSS的单因素及多因素分析
变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.34 0.75~2.38 0.33 — — — 年龄 1.77 0.79~3.96 0.16 — — — 肿瘤部位 1.18 0.63~2.20 0.61 — — — T分期 1.74 0.98~3.10 0.06 — — — 肿瘤直径 1.20 0.67~2.15 0.54 — — — OB试验 1.49 0.83~2.68 0.19 — — — CEA 0.98 0.55~1.74 0.94 — — — Ki-67 0.63 0.33~1.19 0.15 — — — 清扫淋巴数目 2.46 1.32~4.61 0.01 3.41 1.78~6.54 < 0.01 神经/血管侵犯 3.16 1.72~5.83 < 0.01 3.04 1.58~5.88 < 0.01 组织分化 2.45 1.34~4.45 < 0.01 2.16 1.15~4.06 0.02 Fn丰度 2.20 1.20~4.02 0.01 2.19 1.19~4.02 0.01
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表 3 Ⅱ期CRC患者DFS的单因素及多因素分析
变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.69 0.99~2.86 0.05 — — — 年龄 1.77 0.87~3.61 0.12 — — — 肿瘤部位 1.49 0.87~2.56 0.15 — — — T分期 1.42 0.84~2.37 0.19 — — — 肿瘤直径 1.19 0.70~2.02 0.52 — — — OB试验 1.43 0.84~2.42 0.19 — — — CEA 1.02 0.61~1.71 0.94 — — — Ki-67 0.72 0.41~1.26 0.25 — — — 清扫淋巴数目 2.21 1.24~3.93 < 0.01 2.87 1.58~5.21 < 0.01 神经/血管侵犯 2.43 1.36~4.35 < 0.01 2.36 1.27~4.39 < 0.01 组织分化 2.23 1.28~3.88 < 0.01 2.04 1.15~3.64 0.02 Fn丰度 2.03 1.19~3.48 < 0.01 2.00 1.17~3.43 0.01
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表 4 高危组Ⅱ期CRC患者CSS的单因素及多因素分析
变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.33 0.71~2.47 0.37 — — — 年龄 1.68 0.71~3.99 0.24 — — — 肿瘤部位 1.09 0.57~2.11 0.79 — — — T分期 1.18 0.63~2.21 0.61 — — — 肿瘤直径 1.13 0.60~2.11 0.71 — — — OB试验 1.14 0.61~2.11 0.69 — — — CEA 1.25 0.68~2.31 0.48 — — — Ki-67 0.94 0.48~1.81 0.84 — — — 清扫淋巴数目 1.95 1.02~3.73 0.04 3.19 1.57~6.45 < 0.01 神经/血管侵犯 2.47 1.31~4.66 < 0.01 2.81 1.42~5.56 < 0.01 组织分化 1.89 1.01~3.52 0.04 2.04 1.06~3.92 0.03 Fn丰度 2.31 1.21~4.42 0.01 2.20 1.15~4.22 0.02
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表 5 高危组Ⅱ期CRC患者DFS的单因素及多因素分析
变量 HR 95%CI P HR 95%CI P 性别 1.48 0.83~2.64 0.18 — — — 年龄 1.81 0.81~4.05 0.15 — — — 肿瘤部位 1.28 0.71~2.31 0.41 — — — T分期 1.04 0.58~1.84 0.91 — — — 肿瘤直径 1.08 0.60~1.94 0.80 — — — OB试验 1.11 0.63~1.98 0.71 — — — CEA 1.59 0.90~2.80 0.11 — — — Ki-67 1.00 0.55~1.82 0.99 — — — 清扫淋巴数目 1.86 1.02~3.40 0.04 2.81 1.46~5.40 < 0.01 神经/血管侵犯 1.99 1.09~3.65 0.03 2.24 1.17~4.30 0.02 组织分化 1.84 1.03~3.29 0.04 1.99 1.08~3.65 0.03 Fn丰度 2.24 1.23~4.05 0.01 2.13 1.17~3.86 0.01
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