Effect of FXYD domain-containing ion transport regulator 3 on proliferation and migration of human pancreatic cancer cells
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摘要:目的
探讨含FXYD域离子运输调控因子3(FXYD3)对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响。
方法使用免疫组化法、组织病理学和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测21例正常胰腺组织、18例慢性胰腺炎组织和50例胰腺癌组织中FXYD3的表达。分析不同病理特征的胰腺癌中FXYD3的表达水平差异。采用CCK-8法和单克隆实验法检测FXYD3过表达对胰腺癌细胞增殖的影响; 采用Transwell法检测FXYD3过表达对胰腺癌细胞侵袭的影响。
结果FXYD3阳性细胞在正常胰腺组织、慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织样本中的比率分别为0、22.2%和26.0%, FXYD3阳性细胞在慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织中的比率较正常胰腺组织中升高, 差异有统计学意义(P=0.007、0.037)。FXYD3阳性表达与分期、病理分级、淋巴结转移情况以及肿瘤部位无相关性(P>0.05)。CCK-8法结果显示, FXYD3转染的细胞从第3天开始显示出更强的增殖能力, 差异有统计学意义(P < 0.01)。平板克隆实验显示, FXYD3过表达的T3M4细胞克隆数目更多, 差异有统计学意义(P < 0.01)。Transwell法结果显示, FXYD3过表达的T3M4细胞迁移数目较对照组上升, 差异有统计学意义(P < 0.05)。
结论胰腺癌组织中FXYD3显著上调, 这主要是由于癌细胞自身表达水平的增高, 表明FXYD3促进胰腺癌细胞的增殖。
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关键词:
- 含FXYD域离子运输调控因子3 /
- 胰腺癌 /
- 细胞增殖 /
- 细胞迁移 /
- 慢性胰腺炎
Abstract:ObjectiveTo explore the effect of FXYD domain-containing ion transport regulator 3 (FXYD3) on the proliferation and migration of human pancreatic cancer cells.
MethodsImmunohistochemistry, histopathology and real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction (qRT-PCR) were used to detect the expression of FXYD3 in 21 cases with normal pancreas tissues, 18 cases with chronic pancreatitis tissues and 50 cases with pancreatic cancer tissues. The differences of FXYD3 expression level in pancreatic cancer with different pathological characteristics were analyzed. Effect of FXYD3 overexpression on the proliferation of pancreatic cancer cells were detected by CCK-8 assay and monoclonal assay; the Transwell method was used to detect the effect of FXYD3 overexpression on the invasion of pancreatic cancer cells.
ResultsThe ratios of FXYD3 positive cells in samples of normal pancreatic tissues, chronic pancreatitis tissues and pancreatic cancer tissues were 0, 22.2% and 26.0% respectively, and the ratio of FXYD3 positive cells in chronic pancreatitis tissues and pancreatic cancer tissues was significantly higher than that in normal pancreatic tissues (P=0.007, 0.037). There were no correlations of FXYD3 positive expression with staging, pathological grading, lymph node metastasis and tumor sites (P>0.05). The result of CCK-8 method showed that the cells transfected with FXYD3 had significant stronger proliferative ability from the third day (P < 0.01). Colony formation assay showed that the clonal number of T3M4 cells overexpressed with FXYD3 was significantly greater (P < 0.01). The result of Transwell method showed that the migratory number of T3M4 cells overexpressed with FXYD3 was significantly greater than that of the control group (P < 0.05).
ConclusionFXYD3 is significantly up-regulated in pancreatic cancer tissues, which is mainly due to the increase of self-expressed level of cancer cells, indicating that FXYD3 can promote the proliferation of pancreatic cancer cells.
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近年来，分子生物学的研究有助于更好地了解胰腺癌的侵袭行为[1-2]。应用分子生物学分析以评估胰腺癌细胞的基因表达模式，并与正常胰腺和慢性胰腺炎的基因表达模式进行比较，是目前研究的重点[3]。研究[4]表明FXYD高度保守，其家族成员在多种哺乳动物组织和癌症类型中都有差异表达; 该家族由12种水不溶性跨膜蛋白组成，并在通道和(或)离子通道调节蛋白上发挥作用。所有FXYD基因在早期胚胎细胞中表达，并且某些FXYD蛋白的表达在哺乳动物中是呈组织特异性的[5-6]。
研究[7-8]表明，含FXYD域离子运输调控因子3(FXYD3)在人乳腺肿瘤和人乳腺癌细胞株中呈过表达，并且是恶性转化过程的重要组成部分。此外, FXYD3在良性前列腺增生和雄激素依赖型前列腺癌中上调，而在雄激素依赖型前列腺癌中下调[9]。在5-氟尿嘧啶(5-FU)治疗后， FXYD3 mRNA表达在结直肠癌细胞株H630-R10中增加，这表明FXYD3至少在一定程度上导致了该细胞株对5-FU化疗的耐药性[10]。在利用基因芯片技术对胰腺癌基因差异表达的研究[11]中发现, FXYD3在胰腺癌中表达远高于慢性胰腺炎及正常胰腺组织。本研究探讨FXYD3对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响，现将结果报告如下。
1. 材料与方法
1.1 一般资料
胰腺癌(n=50)和慢性胰腺炎(n=18)组织标本取自2019年8月—2021年8月在本院因相应疾病行胰腺切除术的患者。正常胰腺组织(n=21)取自健康志愿者。所有样本均经组织病理学证实符合相应诊断。胰腺癌组年龄22~60岁，平均36岁; 慢性胰腺炎组年龄26~77岁，平均41岁; 正常组年龄33~76岁，平均57岁。
1.2 免疫组化
石蜡包埋组织切片(3~5 μm)进行免疫染色。组织切片在二甲苯中脱蜡，在浓度逐渐降低的乙醇中再水化。将载玻片置于洗涤液[10 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl), 0.85%氯化钠(NaCl), 0.1%牛血清白蛋白(BSA), pH值7.4]中进行免疫染色。采用10 mmol/L柠檬酸缓冲液将组织切片在微波炉中煮沸10 min, 提取抗原后，将切片与正常山羊血清(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD)共孵育45 min, 以阻断非特异性结合位点。切片与稀释在洗涤液中的小鼠单克隆抗FXYD3抗体、小鼠单克隆抗Smad4抗体(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)或正常小鼠IgG作为阴性对照，在4 ℃下过夜。载玻片用洗涤缓冲液冲洗，并与生物素化山羊抗小鼠抗体(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)在室温下孵育45 min。组织切片在洗涤缓冲液中洗涤，并在室温下与链霉亲和素过氧化物酶(Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.)孵育35 min。每个切片用100 μL二氨基联苯胺浓缩液底物混合物(DAKO Corporation, Carpinteria, CA), 然后用苏木精复染。切片清洗，在逐渐增加浓度的乙醇中脱水，并用二甲苯基介质固定。采用Axioplan 2成像显微镜(Carl Zeiss Lichtmicroskopie, Gottingen, Germany)观察玻片。
1.3 组织病理学分析
染色的切片经显微镜检查，并由2名对实验条件不知情的病理学家独立评分。在胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺组织中可见黄色染色颗粒，考虑为FXYD3阳性细胞。每个样本随机选取10个不同的高倍镜视野(10×40), 计数细胞总数和FXYD3阳性细胞数。阳性细胞率=阳性细胞总数/细胞总数×100%。染色强度分为0~3级, 0级为阴性或未染色, 1级为黄色染色, 2级为橙色染色, 3级为棕色染色。染色细胞百分比分类标准: 0分为染色≤5%, 1分为染色>5%~25%, 2分为染色>25%~50%, 3分为染色>50%。最终评分定义为各切片染色强度与染色细胞百分比之和，评分范围为0~6分。为了避免染色伪影，坏死、形态不良和切面边缘的细胞不计算在内。
1.4 人FXYD3过表达载体的构建
采用聚合酶链反应(PCR)合成FXYD3的全长cDNA。正向引物为5′-GACGGATCCAACCTCTGCTCAGCCTGGT-3′; 逆向引物为5′-ATCGAATTCTCTTGCGAGAGGTGAGATGA-3′。将扩增产物与pEGFP-N1哺乳动物表达载体(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA)连接。采用Qiagen质粒试剂盒(Qiagen GmbH, Hilden, Germany)纯化pEGFP-N1/FXYD3过表达质粒。
1.5 T3M4细胞培养与转染
采用Lipofectamin试剂(Life Technologies, Karlsruhe, Germany), 采用FXYD3过表达载体转染T3M4胰腺癌细胞。胰腺癌细胞株在添加10% FCS和100 U/mL青霉素(完全培养基)的DMEM培养基中常规培养，并在5% CO2加湿的环境中培养。
1.6 胰腺癌细胞增殖及迁移能力的检测
使用上述步骤培养的处于对数增长期的胰腺癌细胞株，在96孔板上以4×103个/孔的密度接种，测量密度1次/d, 连续测量4 d。每孔加入100 μL DMEM和10 μL CCK-8, 1 h后在酶标仪上读取吸光度，检测波长为450 nm, 以实验组和对照组与第1天吸光度的比值为纵轴，时间为横轴，绘制胰腺癌细胞增殖曲线。取经处理后的对数生长期T3M4细胞，加入200 μL无血清培养液重悬，上室密度为6×104个/孔，下室添加700 μL DMEM培养液。20 h后取出并用多聚甲醛固定20 min, 洗去多聚甲醛后用结晶紫染色20 min, 洗净结晶紫后擦干并风干制片，显微镜下观察。
1.7 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)
qRT-PCR分析中用于mRNA/cDNA制备的试剂和设备由Roche Applied Science (Mannheim，Germany)提供。采用MagNA纯LC仪自动分离人胰腺组织mRNA, 使用分离试剂盒Ⅰ(细胞)和试剂盒Ⅱ(组织)。使用RT-PCR第1链cDNA合成试剂盒(AMV)，按照制造商的说明制备cDNA。FXYD3引物序列: 正向为5′-GGCCAGAAGTCCGGTCA-3′, 逆向为5′-AACGGTCCTCCACCCAATTTC-3′。采用LightCycler FastStart DNA SYBR Green试剂盒进行实时荧光定量PCR检测。特异性转录本(FXYD3)的数量被归一化为管家基因(亲环蛋白B和HPRT), 并以先前描述的调整转录本/μL cDNA的形式呈现[12]。对于其他人体组织样本，使用UltraSpec RNA分离试剂盒(Biotex Laboratories Inc., Houston, TX)提取总RNA, 并使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)进一步纯化。使用T7~T24引物(5′-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-3′), 15 μg总RNA被逆转录成双链cDNA(GIBCO BRL Life Technologies, Grand Island, NY), 并用锁相凝胶对苯酚/氯仿/异戊基萃取清理(5 Prime-3 Prime Inc., Boulder, CO), 生成含有5 ng/μL双链cDNA的384孔Master板。通过人工生产子板(最终cDNA浓度: 40 pg/μL)。采用TaqMan技术在384孔光学板上进行双实时PCR(目的基因和GAPDH作为内参基因)，并使用ABI Prism PE7900序列检测系统(Perkin-Elmer Applied Biosystems, Lincoln, CA)进行分析。将靶基因的表达水平归一化为内参基因水平，并表示为相对表达，其中ΔCt是内参基因和目标基因周期之间的差异，在此期间扩增超过任意阈值。对于内参基因值，根据8组管家基因的表达值调整各组织的GAPDH Ct值，进一步提高标准化[13]。
1.8 统计学分析
统计分析时，染色评分0~3分为阴性, ≥4分为阳性。所有数据采用SPSS 13.0软件进行分析。FXYD3在正常胰腺组织、慢性胰腺炎和胰腺癌组中的表达及其与临床病理变量的关系使用卡方检验或Fisher精确检验。除非另有说明，否则数值变量结果以均数±标准差表示。采用Student′s t检验(双侧检验)进行统计分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 FXYD3在胰腺癌、慢性胰腺炎和正常胰腺组织中的表达
FXYD3在正常上皮细胞和肿瘤细胞细胞质和(或)细胞膜上表达，细胞质和(或)细胞膜中的染色呈异质性和颗粒状。50例胰腺癌组织标本中，有13例FXYD3阳性细胞，而FXYD3在这些样本中表达呈异质性，同一切片不同区域FXYD3阳性细胞数量及染色强度差异较大。FXYD3阳性细胞在正常胰腺组织、慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织样本中的比率分别为0、22.2%和26.0%, FXYD3阳性细胞在慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织中的比率较正常胰腺组织中升高，差异有统计学意义(P=0.007、0.037), 见表 1。
表 1 FXYD3在不同组织中的表达比较[n(%)]组织 n 阳性 阴性 胰腺癌组织 50 13(26.0)* 37(74.0)* 慢性胰腺炎组织 18 4(22.2)* 14(77.8)* 正常胰腺组织 21 0 21(100.0) 与正常胰腺组织比较, * P < 0.05。 2.2 FXYD3在胰腺癌中的表达与临床病理特征的关系
FXYD3阳性表达与分期、病理分级、淋巴结转移情况以及肿瘤部位无相关性(P>0.05)。见表 2。
表 2 胰腺癌中FXYD3表达与组织病理的关系[n(%)]临床病理特征 分类 n FXYD3 P 阴性 阳性 分期 1期 33 24(72.7) 9(27.3) 0.919 2期 10 8(80.0) 2(20.0) 3期 7 5(71.4) 2(28.6) 4期 0 0 0 病理分级 1级 31 23(74.2) 8(25.8) 1.000 2级 15 11(73.3) 4(26.7) 3级 4 3(75.0) 1(25.0) 淋巴结转移 是 4 4(100.0) 0 0.556 否 46 33(71.7) 13(28.3) 肿瘤部位 胰头 33 24(72.7) 9(27.3) 0.372 胰体 13 9(69.2) 4(30.8) 胰尾 3 3(100.0) 0 全胰 1 1(100.0) 0 2.3 FXYD3对胰腺癌细胞增殖与迁移的影响
将FXYD3过表达载体转染入T3M4细胞，构建了FXYD3过表达的胰腺癌细胞系。使用CCK-8法测试细胞增殖能力，结果显示, FXYD3转染的细胞从第3天开始显示出更强的增殖能力，差异有统计学意义(P < 0.01)，见图 1。平板克隆实验显示, FXYD3过表达的T3M4细胞克隆数目更多，差异有统计学意义(P < 0.01), 见图 2。采用Transwell法检测细胞迁移能力，结果显示, FXYD3过表达的T3M4细胞迁移数目较对照组上升，差异有统计学意义(P < 0.05), 见图 3。上述结果表明, FXYD3过表达是胰腺癌细胞增殖和迁移的促进因素。
3. 讨论
研究[7]表明, FXYD不同亚型的表达具有组织特异性, FXYD1在骨骼肌和心肌中表达, FXYD2主要表达在肾上皮基底膜、胆管和胆管癌细胞中表达, FXYD3主要表达在肝脏、胰腺、胃、结肠、前列腺、肺、肾、骨骼肌和表皮细胞中表达, FXYD4主要在肾脏和远端结肠中表达, FXYD5在大脑中表达。
本研究采用免疫组化的方法，对正常胰腺组织、慢性胰腺炎及胰腺癌组织样本进行免疫组化分析，探讨FXYD3表达与胰腺癌的相关性。分析FXYD3表达差异与几种不同临床病理特征的相关性。FXYD3在不同人体组织中的表达已经通过各种方法被广泛研究。FXYD3在正常的人体组织中表达，包括肝脏、结肠、前列腺、肺、胰腺、大脑和上皮。
研究[14-16]表明, FXYD3在许多不同的肿瘤组织和肿瘤细胞系中表达上调，并且FXYD3的表达与肿瘤恶性程度呈正相关。例如, Morrison等利用定量(q)PCR和Northern blotting证实FXYD3在16例患者的原发乳腺癌组织和8种不同的人乳腺癌细胞株中表达显著增高。值得注意的是，关于FXYD3在前列腺组织中表达的研究得出了相互矛盾的结果[17]。GRZMIL M等[18]使用cDNA芯片技术和qPCR发现FXYD3在前列腺癌症组织样本中高表达。既往关于胰腺癌的研究[19]显示, FXYD3在癌组织和胰腺癌细胞系中的表达明显高于正常胰腺组织和慢性胰腺炎。在非小细胞肺癌中, FXYD3在预后差的患者肿瘤中的表达高于预后好的患者，这表明FXYD3可能是一个重要的预后次要指标[20]。
本研究中, FXYD3阳性细胞在正常组织、慢性胰腺炎组织和胰腺癌组织中的占比分别为0、22.2%和26.0%。这些结果提示FXYD3在胰腺癌形成早期表达，提示FXYD3的上调可能是胰腺发生发展的早期事件。
为证实FXYD3在胰腺癌增殖和迁移中的促进作用，本研究通过体外构建FXYD3过表达载体转染T3M4胰腺癌细胞，结果发现, FXYD3过表达能够显著促进胰腺癌细胞的增殖和迁移。因而，有理由认为FXYD3的上调是胰腺癌进展发生的原因之一，并能够导致周围组织侵犯和远处转移。FXYD3 mRNA在前列腺癌和乳腺癌中相对于各自的正常组织有上调，这已经被其他研究证实。这些数据表明, FXYD3的过表达在胰腺、乳腺癌和前列腺癌等多种肿瘤的发生发展中起着重要作用，且FXYD3可能是一个有前途的胰腺癌生物标志物。
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表 1 FXYD3在不同组织中的表达比较[n(%)]
组织 n 阳性 阴性 胰腺癌组织 50 13(26.0)* 37(74.0)* 慢性胰腺炎组织 18 4(22.2)* 14(77.8)* 正常胰腺组织 21 0 21(100.0) 与正常胰腺组织比较, * P < 0.05。 
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表 2 胰腺癌中FXYD3表达与组织病理的关系[n(%)]
临床病理特征 分类 n FXYD3 P 阴性 阳性 分期 1期 33 24(72.7) 9(27.3) 0.919 2期 10 8(80.0) 2(20.0) 3期 7 5(71.4) 2(28.6) 4期 0 0 0 病理分级 1级 31 23(74.2) 8(25.8) 1.000 2级 15 11(73.3) 4(26.7) 3级 4 3(75.0) 1(25.0) 淋巴结转移 是 4 4(100.0) 0 0.556 否 46 33(71.7) 13(28.3) 肿瘤部位 胰头 33 24(72.7) 9(27.3) 0.372 胰体 13 9(69.2) 4(30.8) 胰尾 3 3(100.0) 0 全胰 1 1(100.0) 0
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期刊类型引用(1)
1. 高静，商卿，胡立娟. 血清丙氨酸与谷氨酰胺水平对胰腺癌患者术后预后效果预测的列线图模型建立与验证. 中国医刊. 2024(11): 1201-1205 . 
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