Randomized controlled trial of preoperative application of high-dose glucocorticoids for prevention of postoperative delirium in patients with partial hepatectomy
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摘要:目的
评价不同剂量糖皮质激素对肝部分切除术患者术后谵妄的预防效果。
方法选取本院2021年1—12月135例拟行腹腔镜肝部分切除术患者为研究对象，随机分为高剂量糖皮质激素组、低剂量糖皮质激素组和安慰剂组，每组45例。麻醉诱导前30 min注射干预药物; 高剂量糖皮质激素组静脉注射甲强龙5.0 mg/kg, 最大剂量500 mg; 低剂量糖皮质激素组静脉注射甲强龙2.5 mg/kg, 最大剂量250 mg; 安慰剂组静脉注射0.9%氯化钠注射液100 mL。术后1、2、3 d时, 采用意识错乱评估法(CAM)评估术后谵妄情况，采用视觉模拟评分法(VAS)评估术后疼痛。记录术中出血量、麻醉药物剂量、手术时间等指标; 记录苏醒延迟、苏醒期躁动、麻醉后监测治疗室(PACU)停留时间、住院时间、术后恶心呕吐(PONV)等情况。
结果高剂量糖皮质激素组术后谵妄发生率低于安慰剂组，差异有统计学意义(P < 0.05)。3组患者术中低血压、出血量、输血例数、瑞芬太尼和丙泊酚用量以及手术时间比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)。3组患者PACU停留时间、苏醒延迟、苏醒期躁动、PONV发生率以及住院时间比较，差异均无统计学意义(P > 0.05)。Logistic回归分析结果显示，术前静脉注射高剂量糖皮质激素(OR=0.032, 95%CI: 0.001~0.968, P=0.048)能够降低术后谵妄风险，而年龄越大(OR=1.379, 95%CI: 1.086~1.751, P=0.008)、苏醒延迟(OR=18.930, 95%CI: 2.541~140.950, P=0.004)则会增加术后谵妄发生的风险。
结论术前静脉注射高剂量糖皮质激素能够有效预防肝部分切除术患者术后谵妄的发生。
Abstract:ObjectiveTo evaluate the effect of different doses of glucocorticoids in prevention of postoperative delirium in patients with partial hepatectomy.
MethodsA total of 135 patients with intended laparoscopic partial hepatectomy in our hospital from January to December 2021 were selected as the research objects, and they were randomly divided into high-dose glucocorticoid group, low-dose glucocorticoid group and placebo group, with 45 cases in each group. Intervention drugs were injected at 30 minutes before anesthesia induction; the high-dose glucocorticoid group received intravenous injection of 5.0 mg/kg methylprednisolone, with a maximum dose of 500 mg; the low-dose glucocorticoid group received intravenous injection of 2.5 mg/kg methylprednisolone, with a maximum dose of 250 mg; the placebo group received intravenous injection of 100 mL 0.9% sodium chloride injection. At 1, 2 and 3 d after operation, postoperative delirium was evaluated by the Confusion Assessment Method (CAM), and postoperative pain was evaluated by the Visual Analogue Scale (VAS). Indicators such as intraoperative bleeding volume, anesthetic dosage and surgical time were recorded; the delayed recovery, restlessness in the awakening stage, residence time in the post-anesthesia care unit (PACU), hospital stay, and postoperative nausea and vomiting (PONV) were recorded.
ResultsIncidence of postoperative delirium in the high-dose glucocorticoid group was significantly lower than that in the placebo group (P < 0.05). There were no significant differences in intraoperative low blood pressure, bleeding volume, cases with blood transfusion, dosages of remifentanil and propofol as well as operation time among the three groups (P > 0.05). There were no significant differences in the residence time in PACU, delayed recovery, restlessness in the awakening stage, incidence of PONV and hospital stay among the three groups (P > 0.05). The result of Logistic regression analysis showed that preoperative intravenous injection of high-dose glucocorticoids (OR=0.032; 95%CI, 0.001 to 0.968; P=0.048) can reduce the risk of postoperative delirium, while older age (OR=1.379; 95%CI, 1.086 to 1.751; P=0.008) and delayed recovery (OR=18.930; 95%CI, 2.541 to 140.950; P=0.004) can increase the risk of postoperative delirium.
ConclusionPreoperative intravenous injection of high-dose glucocorticoids can effectively prevent postoperative delirium in patients with partial hepatectomy.
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Keywords:
- glucocorticoids /
- laparoscopic partial hepatectomy /
- delirium /
- delayed recovery /
- nausea /
- vomiting
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年龄相关性白内障(ARC)为世界首位致盲性眼病，是一种衰老相关的慢性病，其发病率随年龄增长而增加[1-2]。目前，对ARC发生发展的具体分子机制仍然缺乏较全面的了解。长链非编码RNA(LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA, 可在基因的转录、转录后和翻译后等水平调控其表达，在多种生理学和病理学过程中发挥重要作用[3]。研究[4]发现大量LncRNA参与细胞衰老及相关信号通路的调控，影响关键细胞周期过程，如细胞增殖、分化、静止、衰老等。这类衰老相关LncRNA通过表观遗传调控、细胞增殖、端粒稳定性、蛋白质内稳态、细胞间通讯、干细胞池等调控衰老[5]。本研究探讨衰老相关LncRNA PINT对ARC发生发展的影响，现报告如下。
1. 材料与方法
1.1 研究对象
病例组(ARC组)：在扬州大学附属医院眼科被诊断为ARC、接受白内障小切口手法碎核白内障手术患者。收集中度皮质性ARC、重度皮质性ARC、中度核性ARC、重度核性ARC各10眼。纳入标准: 患者年龄50~79岁; 最佳矫正视力低于0.5; 排除标准: 先天性、糖尿病性、外伤性、并发性、药物及中毒性白内障等患者。所有参加研究的患者均无高血压病、糖尿病、自身免疫性疾病及其他氧化损伤性相关疾病。
对照组: ①在扬州大学附属医院眼科被诊断为玻璃体视网膜疾病(如特发性黄斑前膜、特发性黄斑裂孔等)，因年龄和手术等因素需要在玻璃体切除手术中同时行透明晶状体摘除者，共10眼。②扬州市红十字眼库捐献的新鲜眼球。纳入标准[6]: 年龄50~79岁; 晶状体透明。排除标准: 高血压病、糖尿病、自身免疫病及其他氧化损伤性相关疾病者。研究对象签署知情同意书。③人晶状体上皮细胞株SRA01/04(Thermo Fisher Scientific公司)。上述研究方案严格遵循赫尔辛基宣言，且经扬州大学医学院伦理委员会批准。
1.2 RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR
使用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, United States)从ARC和对照组细胞中提取总RNA, 然后使用PrimeScript RT Master Mix(Takara, 中国大连)、Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, Irvine, CA, United States)在ABI 7500实时PCR系统上进行实时PCR分析。选用actin beta作为内参，每个实验重复3次。
1.3 细胞培养和处理
人晶状体上皮细胞株SRA01/04起源于人晶状体上皮细胞，将其培养在DMEM中，含有10%胎牛血清(FBS), 青霉素(100单位/mL)和链霉素(100 μg/mL)。所有细胞在37 ℃, 95%空气和5%二氧化碳的加湿培养箱中培养。氧化损伤组：当生长至80%~90%时，将细胞暴露于过氧化氢(H2O2)(Sigma-Aldrich Corp., St Louis, MO, USA)中，进行氧化损伤。将细胞在含2%FBS的DMEM中孵育过夜，然后在无血清DMEM中孵育30 min。用H2O2(100和200μmol/L)处理24 h后，收集细胞进行不同的测定。衰老组：当细胞生长至80%~90%时，将细胞暴露于小剂量H2O2进行衰老处理。将细胞在含2% FBS的DMEM中孵育过夜，然后在无血清DMEM中孵育30 min, 并用50 μmol/L H2O2培养至7、14、21 d。实验结束时，收取所有细胞并用于不同的检测。平行培养的对照细胞在类似的培养基中生长，不进行处理，作为所有实验的对照。
1.4 质粒构建、慢病毒包装和转染
使用pCDNA3.1载体(Genechem Technology Co., Shanghai, China)。过表达LINC-PINT: 通过PCR生成LINC-PINT序列并克隆到pcDNA3.1载体中。慢病毒包装：将pcDNA、pcDNA-LINC-PINT、si-NC、si-LINC-PINT分别转染进人晶状体上皮细胞株SRA01/04中，转染6 h后，更换新鲜培养液继续培养48 h, 检测转染效率。转染成功后，用于后续实验。
1.5 细胞增殖能力测定
利用CCK8检测试剂盒(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)检测各组细胞的生长增殖情况，分别向处理或未处理的细胞中加入10 μL CCK8试剂, 37 ℃避光孵育3 h, 酶标仪检测450 nm处的吸光度(OD值)，实验重复3次。
1.6 抗氧化能力检测
总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(FRAP法)测定总抗氧化水平。在酸性环境下，还原铁-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生亚铁离子(Fe2+)形式的能力反映了总抗氧化能力。收集100~200万个细胞，加入1.0 mL预冷的提取液，超声充分破碎细胞并释放其中的抗氧化物, 4 ℃、10 000次/min, 离心5 min, 取上清液。样品的抗氧化能力以达到同样吸光度变化值所需的标准液离子浓度表示。
1.7 染色质免疫共沉淀(ChIP)技术
ChIP测定: 使用EZ-Magna ChIP A/G试剂盒(Millipore), 应用抗EZH2(Active Motif)和抗H3K27me3(Active Motif)。将SRA01/04细胞与1%甲醛交联8 min, 然后匀浆。使用Branson Digital Sonifier(Model 450; Branson Ultrasonics Corporation, CT, USA)的微尖探针将匀浆在2级超声处理4次，每次15 s, 每次脉冲之间在冰上间隔40 s, 产生长度为200~800碱基对(bp)的DNA片段。ChIP分析：将等量处理过的染色质添加到含有针对目标蛋白的固定化抗体或阴性对照正常兔IgG抗体的微孔中。在65 ℃温育90 min以逆转交联并洗脱DNA后，使用快速旋转柱进行DNA纯化，然后进行实时PCR检测。
1.8 统计分析
采用IBM SPSS Statistics 20.0软件进行数据分析，所有结果数据以平均值±标准差表示。2组之间的差异采用非配对的Student′s t检验或方差分析进行比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 LINC-PINT在ARC中的表达
使用高通量RNA序列分析、确定ARC组和对照组晶状体上皮细胞之间的差异表达。ARC组LINC-PINT的表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05)。LINC-PINT的表达水平与ARC分级呈正相关。见图 1。
2.2 衰老相关LncRNA与氧化损伤/衰老的关系
在晶状体上皮细胞中，氧化损伤组和衰老组中LINC-PINT表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.05), 且分别呈现为剂量依赖性或时间依赖性的正相关，见图 2、图 3。
2.3 建立过表达/敲低模型
将pcDNA、pcDNA-LINC-PINT、si-NC、si-LINC-PINT分别转染进人晶状体上皮细胞SRA01/04中，通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞中相关基因的表达量变化，发现转入pcDNA-LINC-PINT后，靶基因CCNA2、CDK1、PCNA表达减少; 转入si-LINC-PINT后，靶基因CCNA2、CDK1、PCNA表达增加，见图 4。同时, LINC-PINT改变抗氧化损伤能力，见图 5。CCK8显示在LINC-PINT过表达的细胞中细胞增殖被抑制，见图 6。
2.4 衰老相关LncRNA与转录因子的调控机制
在模拟物和LINC-PINT过表达的细胞中进行ChIP, 测定表观遗传修饰物与LINC-PINT靶基因的启动子区域之间的相互作用。LINC-PINT与EZH2相互作用。LINC-PINT将EZH2招募到CDK1、CCNA2和PCNA基因的启动子上，导致H3K27三甲基化和靶基因的表观遗传学沉默。见图 7。
3. 讨论
LncRNA PINT是由p53诱导的核LncRNA, 直接与PRC2相互作用，且是PRC2特异靶基因中的组蛋白H3K27甲基化所必需的。研究[7]表明, LINC-PINT的功能依赖于PRC2的表达水平，并通过与PRC2相互作用调控转化生长因子-β(TGF-β)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和p53细胞通路中的蛋白质表达水平，而这些通路与氧化损伤、衰老和衰老相关性疾病有关。p53及其下游p21蛋白是重要的细胞周期相关蛋白，广泛参与了细胞的增殖、分化、凋亡等多种生理及病理过程。研究[4, 8]表明, LncRNA是p53/p21信号通路的重要组成部分，而调控表观遗传学变异的LncRNA PINT在p53/p21信号通路中扮演着重要的角色。p53能通过诱导LncRNA PINT的表达，与PRC2相互作用，从而终止基因转录，调控p53信号通路中蛋白质的表达水平，调控细胞周期进程，从而影响机体的衰老以及衰老相关疾病的发生发展。
ARC与表观遗传因素密不可分。研究[9-10]报道, LncRNA与许多眼病相关，如青光眼、后发性白内障、糖尿病性视网膜病变、增生性玻璃体视网膜病变、眼部肿瘤等。其中有报道[11]表明LncRNA PAUPAR通过调控组蛋白H3K4的去甲基化进而抑制葡萄膜黑色素瘤的发生。作者的前期研究[12-13]提示，在人晶状体上皮细胞株SRA01/04中，高浓度短时间的氧化损伤可诱导氧化损伤模型，而低浓度长时间的氧化损伤可诱导衰老模型。ARC的衰老发病机制与氧化损伤机制紧密相扣，氧化损伤相关的表观遗传学改变与ARC密切相关[14]。因此，衰老相关LncRNA可能通过参与表观遗传学调控影响细胞衰老，进而引起ARC。
本研究初步阐明了LncRNA PINT可能通过p53/p21通路调控相关基因的表观遗传改变，参与ARC的发生发展，揭示了衰老相关LncRNA在ARC发病机制中起到重要作用，可作为ARC防治的新靶点。本研究从表观遗传学水平探讨ARC发病机制，为ARC防治提供新思路，有助于研发抗ARC药物，为进一步深入了解白内障的发病机理提供了理论基础和方向。
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表 1 3组患者一般资料比较$ \left( {\bar x \pm s} \right)$[n(%)]
一般资料 高剂量糖皮质激素组(n=44) 低剂量糖皮质激素组(n=44) 安慰剂组(n=45) 年龄/岁 58.2±3.38 58.4±3.58 58.9±3.87 性别 男 23(52.3) 25(56.8) 23(51.1) 女 21(47.7) 19(43.2) 22(48.9) BMI/(kg/m2) 22.1±2.4 22.7±2.8 22.0±3.1 吸烟 15(34.1) 13(29.5) 10(22.2) 饮酒 14(31.8) 10(22.7) 10(22.2) ASA分级 Ⅱ级 33(75.0) 34(77.3) 37(82.2) Ⅲ级 11(25.0) 10(22.7) 8(17.8) 高血压 12(27.3) 15(34.1) 14(31.1) 糖尿病 11(25.0) 14(31.8) 16(35.6) 慢性阻塞性肺疾病 4(9.1) 5(11.4) 2(4.4) 低蛋白血症 13(29.5) 15(34.1) 12(26.7) 肝脏切除节段(≥3个节段) 11(25.0) 10(22.7) 8(17.8) BMI: 体质量指数; ASA: 美国麻醉医师协会。 
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表 2 3组患者术中及术后情况比较$ \left( {\bar x \pm s} \right)$[n(%)]
指标 高剂量糖皮质激素组(n=44) 低剂量糖皮质激素组(n=44) 安慰剂组(n=45) 低血压 6(13.6) 6(13.6) 8(17.8) 出血量/mL 585.0±97.0 561.0±82.0 589.0±88.0 输血例数 4(9.1) 2(4.5) 5(11.1) 瑞芬太尼用量/μg 1 277.0±358.0 1 219.0±306.0 1 303.0±334.0 丙泊酚/mg 592.0±75.0 574.0±69.0 587.0±83.0 手术时间/min 159.0±22.0 153.0±28.0 160.0±31.0 PACU停留时间/min 28.0±7.0 25.0±7.0 26.0±8.0 苏醒延迟 5(11.4) 3(6.8) 5(11.1) 苏醒期躁动 4(9.1) 4(9.1) 3(6.7) PONV 1(2.3) 1(2.3) 2(4.4) 住院时间/d 7.2±0.6 7.3±0.6 7.4±0.6 谵妄 1(2.3)* 5(11.4) 9(20.0) 最大VAS评分/分 3.5±0.7 3.5±0.8 3.4±1.0 PACU: 麻醉后监测治疗室; PONV: 术后恶心呕吐; VAS: 视觉模拟评分法。与安慰剂组比较, *P < 0.05。
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表 3 术后谵妄影响因素的Logistic回归分析
危险因素 B SE Wald P OR(95%CI) 高剂量糖皮质激素 -3.444 1.741 3.916 0.048 0.032(0.001~0.968) 低剂量糖皮质激素 -0.778 0.808 0.951 0.330 0.455(0.093~2.216) 年龄 0.321 0.122 6.950 0.008 1.379(1.086~1.751) 性别 -0.760 0.849 0.802 0.371 0.468(0.089~2.469) 苏醒期躁动 2.139 1.137 3.536 0.060 8.487(0.914~78.850) 苏醒延迟 2.940 1.024 8.238 0.004 18.930(2.541~140.950)
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