哮喘是全球最常见的慢性病之一 ^[1]。气道高反应性(AHR)是过敏性哮喘的主要特征^[2]。AHR与气道平滑肌(ASM)收缩有关，并受胞质钙离子(Ca²⁺)水平调节，突出了Ca²⁺稳态在哮喘中的重要性^[2]。全基因组分析确定了12个与哮喘相关的表观遗传相互作用基因，包括基质相互作用分子1(STIM1)^[3]。STIM1是一种钙调节激素，广泛分布于肾脏、子宫内膜和肺等组织中，可以通过激活钙通道蛋白1(Oria1)介导钙库操纵的钙内流(SOCE)^[4]。因此，本研究假设STIM1可能是与哮喘AHR相关的重要上皮衍生因子，其通过介导Ca²⁺流入来调节ASM收缩。验证这一假设，本研究拟通过建立哮喘小鼠模型，探讨STIM1/Orail信号通路介导的SOCE在AHR中的作用。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

36只雌性Balb/c小鼠[8~10周龄, (20.0±1.1) g]购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠在标准条件[温度为(22±1) ℃; 湿度为55%~60%; 12 h明暗循环)]下饲养，可自由获取水和食物。适应1周后，将小鼠随机分为3组(每组12只)，即对照组(CON)、鸡卵清蛋白(OVA)组和OVA+sh-STIM1组(OVA来源于鸡蛋，是一种常用的过敏原，可在实验室啮齿动物中诱发过敏性肺部炎症。)。参照文献[5]中方法建立OVA诱导的小鼠急性哮喘模型。除对照组外，其他组分别在第0、7、14天通过腹腔注射50 μg OVA(纯度≥98%, 美国Sigma-Aldrich公司)致敏。小鼠用异氟醚麻醉，连续3 d(第21、22、23天)通过吸入溶解在100 μL生理盐水中的150 μg OVA进行致敏。对照组采用等量生理盐水处理。OVA+sh-STIM1组小鼠在第21、22、23天用OVA致敏前8 h, 通过鼻内给予100 μL慢病毒介导的STIM1小干扰RNA[sh-STIM1, 汉恒生物科技(上海)有限公司]。

1.2   慢病毒介导的短发夹载体的构建与感染

对于短发夹RNA (shRNA) 介导的STIM1敲低，用从上海GeneChem Corporation公司购买的STIM1-pGCSIL-GFP质粒产生的慢病毒颗粒转染细胞。shRNA的靶向序列为^[6]: 5′-GGAGGATAATGGCTCTATT-3′。阴性对照是与任何已知人类基因没有序列同源性的双链shRNA。对于基因沉默，将纯化的慢病毒(sh-STIM1-1)以20的感染复数添加到细胞中，持续8 h, 并用培养基洗涤2次。通过GFP表达监测发现感染复数为20时, 72 h后癌细胞感染率超过90%。因此，本研究在所有实验中对慢病毒使用了20的感染复数，因为其在所需的时间内产生了最佳的基因敲低。对照细胞用阴性对照shRNA感染。

1.3   气道高反应性的测量

在实验第24天，通过全身气压体积描记在8~10周龄的小鼠(每组6只小鼠)中评估对乙酰甲胆碱(Mch, 美国Sigma-Aldrich公司)的气道反应性。小鼠用戊巴比妥(100 mg/kg)腹腔注射麻醉，并暴露于含Mch(0、3.125、6.250、12.500、25.000和50.000 mg/mL)的磷酸盐缓冲液(PBS)雾化中，利用全身瀑体积测量法(型号PLY 3211, 美国Buxco Electronic公司)记录增强的停顿(Penh)。

1.4   苏木精和曙红染色及炎症评分

在实验第24天，处死小鼠，取右上叶石蜡包埋，矢状切片(5 μm厚)，苏木精-伊红(HE)染色。将炎症浸润程度定为: 0分，无炎症细胞; 1分，炎症细胞少; 2分，炎症细胞呈圆形，厚度为1个细胞; 3分，炎症细胞呈圆形，厚度为2~4个细胞; 4分，炎症细胞形成圆形，厚度>4个细胞。由对样本不知情的研究人员在每张载玻片上随机选择的6个区域中对炎症进行评分。总炎症评分计算为所有个体炎症评分的平均值。

1.5   免疫荧光染色

肺组织切片(5 μm) 进行抗原修复，并在室温下浸入山羊血清15 min, 以避免非特异性结合。然后将切片与1∶ 50稀释的抗STIM1 (美国Santa cruz公司) 一抗在4 ℃下孵育过夜。PBS洗涤3次后，将切片与1∶ 200稀释的Cy3标记的山羊抗兔IgG抗体(上海Beyotime公司)在室温下一起孵育90 min。最后，切片用二脒基苯基吲哚(DAPI)染色并用PBS洗涤3次。在放大倍数为400倍的荧光显微镜下观察切片。

1.6   免疫组织化学

通过免疫组织化学染色检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肺组织中的表达。用于免疫染色的主要抗体如下: 兔抗α-SMA多克隆抗体(1∶ 100, 英国Abcam公司)。二级抗体为HRP标记的抗兔抗体(美国Jackson ImmunoResearch公司)。

1.7   酶联免疫吸附试验(ELISA)

所有组均进行气管分离，行气管插管，用0.5 mL PBS灌洗小鼠支气管肺泡，收集支气管肺泡灌洗液(BALF), 共3次，每次回收率达82%。根据ELISA试剂盒说明(美国R&D公司)，检测小鼠BALF中白细胞介素(IL)-4、IL-5、单核细胞趋化蛋白(MCP-1)和IL-13水平。

1.8   细胞培养

人气道平滑肌细胞(HASMC，美国Sciencell公司)接种在SMCM培养基(Sciencell)中，并在37 ℃、5%CO₂的湿润环境中培养。HASMC连续传代并取第4代用于实验。将HASMC以1×10⁴个细胞/cm²的密度接种在细胞培养板中。细胞实验分为4组: 对照组(CON)、ACh组、ACh+sh-STIM1组和sh-STIM1组。ACh+sh-STIM1组和sh-STIM1组细胞在乙酰胆碱(ACh)干预前用sh-STIM1-1感染细胞8 h，以敲低细胞中STIM1表达。

1.9   细胞收缩试验

将HASMC重新悬浮在使用冷胶原蛋白Ⅰ型(纯度=90%, 溶于0.02 mol/L乙酸的液体, 1.5 mg/mL, 美国BD Biosciences公司)制备的胶原蛋白溶液中，该胶原蛋白溶液每孔含有1.5×10⁵个细胞。将凝胶加入24孔板(600 μL/孔) 并在37 ℃下聚合90 min。将ACh(美国Sigma-Aldrich公司)添加到适当的孔中至终浓度为100 μmol/L, 并在4 h时拍摄照片。处理后立即使用灭菌探针从孔边缘提起凝胶。使用NIH Image J在每个时间点测量每个凝胶的表面积。

1.10   钙成像

通过Fura-2AM(钙离子荧光探针，上海Beyotime公司)测量HASMC中的钙成像。将24孔板(2.5×10³个细胞/孔)中的HASMC与250 μL含有2.5 μL/mL Fura-2AM的标准林格氏溶液(pH值为7.4)孵育30 min。然后用HBSS洗涤细胞3次。将HBSS中的ACh(100 μmol/L)或thapsigargin抑制剂(TG, 2 μmol/L)添加到相关孔中，并在37 ℃下孵育2 h。去除上清液以拍摄图像。使用珀耳帖冷却电荷耦合器件(CCD)相机(美国Roper Scientific公司)在荧光显微镜(10倍物镜)下检测细胞中的Fura-2AM荧光。使用荧光滤光片组在495 nm和518 nm处交替获得Fura-2AM荧光。信号转换为相对变化(F/F0), 其中F0是时间0的平均荧光强度(495/518)的比率。每孔记录15个细胞。

1.11   蛋白质印迹

使用SDS裂解缓冲液收获细胞。不同处理组中等量的蛋白质进行10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移到硝酸纤维素膜(美国Millipore公司)。膜在3%牛血清白蛋白(BSA)中封闭，随后与兔多克隆Oria1抗体(1∶ 1 000, 美国Cell Signaling Technology公司)、兔单克隆抗体GAPDH(1∶ 1 000, 美国Cell Signaling Technology公司)在4 ℃下孵育过夜。HRP偶联的单克隆山羊抗兔IgG(1∶ 5 000, 上海Bioworld公司)抗体用作二抗。使用ECL试剂(美国Millipore公司)显示条带。使用NIH Image Pro对光密度扫描进行量化，并将值表示为与GAPDH相比的相对强度。

1.12   实时定量聚合酶链反应(PCR)

使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)分离总RNA。然后使用PrimeScript^TM逆转录酶(日本Takara公司)将1 μg总RNA逆转录cDNA, 并使用TaqMan Gene Expression Assay试剂盒在ABI Prism 7000(美国Applied Biosystems公司)上进行定量实时PCR分析。PCR中使用的引物如下, STIM1 : 5′-AGTCACAGTGAGAAGGCGAC-3′(正向), 5′-CAATTCGGCAAAACTCTGCTG-3′(反向); Orai1 : 5′-GACTGGATCGGCCAGAGTTAC-3′(正向), 5′-GTCCGGCTGGAGGCTTTAAG-3′(反向); GAPDH: 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′ (正向), 5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′(反向)。循环条件是在95 ℃下初始变性30 s, 然后在95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s和72 ℃ 10 min进行40个循环。使用2^-△△CT方法计算数据并归一化为GAPDH。

1.13   统计学分析

所有数据均以(x±s)表示。使用SPSS 22.0软件分析数据。使用单向方差分析检查2组以上的差异，然后在小鼠实验中采用Tukey事后分析以及细胞实验中采用Student-Newman-Keuls事后分析进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   STIM1在鼠支气管上皮细胞中高表达

OVA组小鼠表现出气道阻力增加(图 1A)以及组织(图 1B)和BALF(图 1C、D)炎症。免疫荧光染色分析表明，与对照组相比，在OVA处理动物的支气管上皮细胞中STIM1表达增加(图 1E、F), 差异有统计学意义(P < 0.05)。这些结果表明STIM1在哮喘过敏模型中表达增加。

图  1  STIM1在鼠支气管上皮细胞中高表达

A: 气道阻力的评估，各组通过flexiVent测量对乙酰甲胆碱(0~50 mg/mL)剂量增加的气道阻力，以记录增强暂停(n=6); B: 气道炎症的评估，苏木精-伊红染色观察支气管周围和肺泡区域的炎性细胞浸润; C: 各组之间的BALF中总白细胞计数; D: OVA组和OVA+sh-STIM1组BALF中白细胞的数量(NEU: 中性粒细胞; LYM: 淋巴细胞; MON: 单核细胞; EOS: 嗜酸性粒细胞); E、F: 各组支气管上皮细胞中STIM1表达的免疫荧光染色分析。与对照组相比, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; 与OVA组相比, #P < 0.05, ###P < 0.001。

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2.2   STIM1敲低消除过敏性哮喘小鼠OVA诱导的AHR和ASM收缩

为了确定STIM1水平的降低是否与过敏性哮喘的病理学相关，本研究探讨了STIM1敲低对AHR的影响(图 1E、F)。与对照组相比, OVA组Mch激发后气道阻力增加，这被鼻内sh-STIM1逆转(图 1A、B)。免疫组织化学分析表明, OVA增强α-SMA表达(ASM激活的标志物)被鼻内sh-STIM1显著抑制(图 2)。这些结果表明STIM1在哮喘AHR中具有作用。

图  2  通过免疫组织化学定量支气管周围α-SMA蛋白表达和定量分析(n=6)

与对照组相比, **P < 0.01; 与OVA组相比, #P < 0.05。

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2.3   STIM1敲低抑制炎症细胞浸润及相关因子释放

OVA显著增强肺泡和支气管周围的炎性细胞浸润，鼻内sh-STIM1治疗显著减弱(图 1B)。BALF细胞计数表明, sh-STIM1给药显著抑制BALF中的细胞总数以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量(图 1C、D)。OVA增强BALF表达Th2细胞因子释放，并且sh-STIM1治疗减弱OVA诱导的IL-13、IL-5和MCP-1释放，但对OVA诱导的IL-4释放无影响。见表 1。

表  1  STIM1敲低对BALF中炎症因子释放影响(n=6)(x±s)  pg/mL

组别	IL-13	IL-4	IL-5	MCP-1
CON组	48.23±1.30	15.28±2.83	6.53±1.12	5.45±0.82
OVA组	137.65±15.42***	27.62±3.25*	37.92±3.84**	38.72±4.67***
OVA+sh-STIM1组	71.49±8.74###	22.13±3.36	23.63±2.55#	14.91±2.51#
IL: 白细胞介素; MCP-1: 单核细胞趋化蛋白。与对照组相比, * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001; 与OVA组相比, #P < 0.05, ###P < 0.001。

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2.4   STIM1敲低对ASM细胞的收缩力和Ca²⁺流入影响

为了进一步探讨STIM1对ASM的影响，本研究在体外使用了HASMC。ACh(100 μmol/L) 诱导胶原基质中的HASMC在4 h后收缩约80%, 而对照组收缩约40%。sh-STIM1对HASMC的收缩没有影响[(41.31±3.27)%与(44.49±0.36)%]。然而，与sh-STIM1预处理显著抑制ACh诱导的收缩，表明ACh通过降低ASM收缩性来调节AHR(图 3A)。ASM收缩性由Oria1调节, ACh增加Oria1表达，通过sh-STIM1预处理完全减弱(图 3B)。ACh以浓度依赖性的方式增加了HASMC的SOCE, 这被sh-STIM1预处理完全消除(图 3C)。用非竞争性Ca²⁺ATP酶TG抑制剂(2.0 μmol/L)和1.2 mmol/L Ca²⁺处理HASMC可激活SOCE, 并进一步升高细胞质Ca²⁺水平，而sh-STIM1可降低这种效应(图 3D)。PCR结果显示, TG增强了 STIM1 mRNA和 Orai1 mRNA在HASMC中的表达，而sh-STIM1抑制了 STIM1 和 Orai1 表达(图 3E)。

图  3  STIM1敲低对ASM细胞的收缩力和Ca²⁺流入影响

A: 用sh-STIM1和ACh处理ASM细胞的凝胶收缩代表性图像; B: Oria1蛋白表达的代表性免疫印迹图像和定量分析; C: sh-STIM1抑制ACh诱导的细胞溶质Ca²⁺增加(F/F0代表 3个独立实验的平均峰值荧光强度变化); D: sh-STIM1抑制TG诱导的细胞溶质Ca²⁺增加; E: 通过RT-qPCR测定sh-STIM1对ASM细胞中STIM1和Orai1 mRNA表达的影响。与对照组相比, ***P < 0.001; 与ACh或TG组相比, #P < 0.05, ###P < 0.001。

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3.   讨论

哮喘是一种复杂的疾病; AHR是哮喘表现的核心，与ASM收缩变化密切相关^[7]。Ca²⁺信号对ASM细胞收缩、生长和迁移至关重要。SOCE通道是Ca²⁺进入ASM细胞的普遍方式之一^[8]。STIM1是内质网中的Ca²⁺传感器，其在限定的内质网/质膜连接区域寡聚化，以激活Orai1形成SOCE通道^[9]。STIM1/Orai1偶联的机制包括将STIM1的约100个氨基酸的C端卷曲螺旋区与Orai1四聚体的C端和N端直接结合^[10]。哮喘中的ASM收缩变化与Ca²⁺处理异常以及离子通道及泵的表达变化有关^[11]。本研究数据表明，气道上皮源性STIM1增加可能与ASM收缩和AHR有关，表明STIM1可能是一种潜在的内皮源性收缩因子。

上皮细胞是抵抗气道中有毒和过敏物质的第一道防线。除了物理屏障功能外，气道上皮还通过释放环氧合酶产物和内皮源性收缩因子在ASM张力的调节中发挥作用。本研究表明，STIM1主要定位于支气管上皮，对过敏性哮喘小鼠模型鼻内给予sh-STIM1可降低AHR。IL-13是一种Th2型细胞因子，与过敏性哮喘的发病有关^[12]。IL-13除了对杯状细胞增生和增加黏液产生作用外，还可直接调节ASM的高收缩性，从而诱导哮喘患者的AHR^[13]。此外, IL-13增加了HASMC对各种收缩剂(如组胺)的Ca²⁺反应^[14]。这些结果强调了IL-13在过敏性哮喘AHR中的作用。本研究中, STIM1敲低可降低哮喘小鼠的AHR和炎症反应，表明STIM1对哮喘具有恶化作用, STIM1的过度活跃可能是对IL-13诱导的炎症应激反应的一种代偿机制。这一发现与既往研究^[15-16]一致，表明STIM1是一种应激反应蛋白，参与诱导组织损伤，如急性肺损伤和心肌梗死。

ASM的超收缩性与哮喘的AHR密切相关^[7]。一般ASM收缩是在气道炎症的背景下研究。然而，在使用胶原凝胶收缩试验对单个ASM细胞进行的研究中, ASM收缩不仅与气道炎症有关，还可能是由哮喘固有异常引起的，该异常在没有哮喘气道环境的原代培养中持续存在，表明哮喘ASM发生表观遗传或信号通路重塑^[17]。ASM收缩是由增加的胞浆Ca²⁺水平引起的，随后开始形成Ca²⁺-钙调蛋白-肌球蛋白轻链激酶复合物，激活Oria1介导的SOCE。在此基础上，本研究探讨了STIM1对ASM收缩的作用。本研究结果显示，鼻内滴注sh-STIM1逆转了OVA诱导的过敏小鼠AHR。sh-STIM1通过抑制钙依赖性Oria1表达，进而抑制HASMC收缩性。由于SOCE对调节HASMC的Ca²⁺稳态至关重要，Oria1与STIM1的相互作用对SOCE具有正性调节作用^[18]。因此, STIM1通过直接调节ASM内在收缩和间接控制过敏性哮喘炎症的关键特征来促进AHR, 从而使STIM1成为内皮源性收缩因子。

综上所述，本研究证明上皮细胞中STIM1调节ASM收缩和AHR, 其作用机制与激活Oria1介导的SOCE有关。这些数据为整合哮喘上皮细胞和ASM细胞相互作用以及增强AHR的机制提供了新见解，进而促进了对哮喘发病机制的深入理解。