Study on inactivation effect of quaternary ammonium salts disinfectant concentrate and quaternary ammonium salts disinfectant wipes on severe acute respiratory syndrome coronavirus-2
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摘要:目的 探讨复合季铵盐消毒液及消毒湿巾对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的灭活效果。方法 采用悬液定量杀灭试验方法，分析复合季铵盐消毒液及其消毒湿巾灭活SARS-CoV-2的效果。结果 复合季铵盐消毒液主要成分为4种单双链季铵盐混合物，使用浓度432 mg/L，作用时间1 min时，对悬液内SARS-CoV-2灭活对数值>4.0；以该复合季铵盐消毒液制备而成的消毒湿巾挤出液浓度820 mg/L，作用时间1 min时，对悬液内SARS-CoV-2灭活对数值>4.0。结论 复合季铵盐消毒液及消毒湿巾在低浓度下可快速有效灭活SARS-CoV-2。Abstract:Objective To study the inactivation effect of QUAT disinfectant concentrate and QUAT disinfectant wipes on severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2).Methods The suspension quantitative killing test method was used to analyze the effect of the QUAT disinfectant concentrate and QUAT disinfectant wipes in inactivating the SARS-CoV-2.Results The main ingredients of the QUAT disinfectant concentrate and QUAT disinfectant wipes were four single and double-chain quaternary ammonium salts mixtures, and the inactivation log value of novel coronavirus SARS-CoV-2 in suspension was greater than 4.0 when the concentration was 432 mg/L and the action time was 1 min. The squeezed solution of the QUAT disinfectant wipes prepared with the QUAT disinfectant concentrate had a concentration of 820 mg/L, the logarithmic value of inactivation of the SARS-CoV-2 in the suspension was greater than 4.0 when the action time was 1 min.Conclusion The QUAT disinfectant concentrate and QUAT disinfectant wipes can quickly and effectively inactivate the SARS-CoV-2 at low concentrations.
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新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于β属冠状病毒，对紫外线和热敏感，乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等均可有效灭活病毒。SARS-CoV-2主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，人群普遍易感[1]。SARS-CoV-2和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-1)的稳定性非常接近，在气溶胶至少可以存活3 h, 铜表面至少4 h, 硬纸盒表面24 h, 不锈钢和塑料表面2~3 d[2]。当下尚未找到对SARS-CoV-2有确切疗效的抗病毒药物。SARS-CoV-2感染的预防仍然需依赖可靠的消毒方法与隔断措施，其中呼吸道预防、手消毒和环境物体表面消毒都属于特别有效的手段。SARS-CoV-2的消毒措施和方案尚有待于进一步探索。本研究选取了复合季铵盐消毒液及季铵盐消毒湿巾作为研究对象，以期为SARS-CoV-2在环境物体表面的杀灭与防控提供技术支持。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
研究所用复合季铵盐消毒液(商品名为宝泰芮®季铵盐消毒液)由杭州氢源素生物科技有限公司提供，主要有效成分为17.28%烷基苄基氯化铵、12.96% 辛基癸基二甲基氯化铵、5.18%双辛基二甲基氯化铵和7.78%双癸基二甲基氯化铵的混合物。以该复合季铵盐消毒液制备而成的宝泰芮®卫生湿巾(以下简称消毒巾)，其挤出液季铵盐含量为820 mg/L。
试验病毒株为SARS-CoV-2病毒株; 细胞系为非洲绿猴肾细胞(Vero-E6)。
1.2 方法
1.2.1 病毒悬液制备
从液氮中取出冻存的Vero E6试验宿主细胞，在37 ℃温水中迅速融化，并用细胞维持液DMEM洗涤2次后，转种于加有完全培养基的培养瓶中。将Vero-E6作为阴性对照组。观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用于消毒试验。取出低温冻存的病毒株, 37 ℃解冻，接种于含已经长满单层细胞的细胞瓶内，置37 ℃温箱中，使与细胞吸附、生长。观察病变，待3/4细胞出现病变时，收获病毒。离心后，将含病毒的上清液分装于无菌离心管中，冷冻保存于-80 ℃备用。
1.2.2 中和鉴定试验
复合季铵盐消毒液采用中和稀释法，使用1∶500消毒液与中和剂进行试验，中和剂为1 g/L硫代硫酸钠和1 g/L卵磷脂，并参照2002年版《消毒技术规范》[3]中的病毒悬液定量法中和剂鉴定试验操作程序。试验重复3次，且3次重复试验结果一致。
消毒湿巾采用稀释法，其挤出液参照EN 14476[4]中的方法进行。将0.5 mL牛血清白蛋白(BSA)3 g/L、绵羊红细胞(sRBC)3 mL/L加入至5 ℃的4 mL消毒湿巾挤出液(100%)中，混合均匀后，载入MicrospinTM S 400 HR柱中，每柱3×0.1 mL。735 g离心分离2 min后，收集洗脱后的样品。180 μL洗脱样品与20 μL病毒混悬液混合。然后在低温稀释培养基DM中进行稀释，即稀释10-1~10-3, 冰上培养(30 min±10 s)。每一稀释液进行滴度测定。
1.2.3 病毒灭活试验
复合季铵盐消毒液依照2002年版《消毒技术规范》[3]中的病毒灭活试验操作程序。在20 ℃条件下用复合季铵盐消毒液按照1∶1 000、1∶500稀释比例配制的使用浓度为432 mg/L和864 mg/L的消毒液进行试验。各浓度对应作用时间均为1、3、5 min。
消毒湿巾挤出液按照EN 14476[4]中的病毒灭活试验操作程序，将0.5 mL BSA 3 g/L+ sRBC 3 mL/L(有机干扰物) 和0.5 mL病毒混悬液、4 mL (20±1) ℃恒温的测试样品挤出液(100%)混合60 s后，载入MicrospinTM S 400 HR柱中，每柱12×0.1 mL。735×g离心2 min, 收集洗脱后的样品进行梯度稀释，即取1 mL样品加至9 mL低温培养基中，对于每一步的稀释液，在(30 min±10 s)内进行滴度测定。
1.3 统计学分析
采用SPSS 23.0统计软件建立数据库，并进行统计分析。
2. 结果
2.1 中和鉴定试验结果
复合季铵盐消毒液的3次中和剂鉴定试验结果显示，中和剂1 g/L硫代硫酸钠和1 g/L卵磷脂可有效中和该复合季铵盐消毒液对试验病毒及其宿主细胞的残留作用，且中和剂和中和产物对病毒和宿主细胞均无不良影响。3次中和剂鉴定试验2、3、4各组间误差率分别为5.6%, 3.5%, 2.2%。见表 1。消毒湿巾挤出液的中和鉴定试验结果显示，在10-1中和稀释度时，可有效停止灭活病毒。
表 1 中和剂鉴定试验结果组别 方法 每次试验TCID50的对数值 每组平均TCID50的对数值 第1次 第2次 第3次 1组 消毒液+病毒液+中和剂 0.50 0.50 0.50 0.50 2组 病毒液+中和剂 5.00 4.75 5.00 4.92 3组 病毒液+中和产物 4.50 4.50 4.75 4.58 4组 病毒液(阳性对照) 5.25 5.00 5.00 5.08 TCID50: 50%组织细胞感染量。 2.2 病毒杀灭试验结果
该复合季铵盐消毒液按照1∶1 000、1∶500稀释，分别与SARS-CoV-2作用1、3、5 min后接种Vero-E6细胞，结果显示该复合季铵盐消毒液使用浓度为432 mg/L、864 mg/L时，上述时间内，均能够有效杀灭SARS-CoV-2。见表 2。
表 2 复合季铵盐消毒液对SARS-CoV-2病毒灭活效果消毒液浓度 作用时间 1 min 3 min 5 min 864 mg/L(1∶500稀释) 有效灭活 有效灭活 有效灭活 432 mg/L(1∶1 000稀释) 有效灭活 有效灭活 有效灭活 有效灭活: 病毒液(阳性对照)病毒滴度对数值≥5.0时，细胞无病变，与阴性对照组细胞生长情况一致。 消毒湿巾挤出液与SARS-CoV-2作用1 min后，灭活对数值>4.0, 符合《消毒技术规范》及EN 14476的要求。见表 3。
表 3 消毒湿巾对SARS-CoV-2病毒灭活效果试验病毒株 试验浓度 平均灭活对数值 平均TCID50的对数值 1 min SARS-CoV-2 挤出液原液 4.10 7.05 TCID50: 50%组织细胞感染量。 3. 讨论
乙醚、氯仿、含氯消毒剂、过氧乙酸和75%乙醇虽然均可有效灭活SARS-CoV-2, 但都存在不同程度的安全隐患[5-6]。乙醚和氯仿不属于消毒产品范畴; 含氯制剂和过氧乙酸均为强氧化性物质，属高水平消毒剂，对人体和金属都具有腐蚀刺激性，不宜用于环境表面的日常消毒[7]; 75%乙醇属于易燃易爆品，不适用于大范围普通物体表面消毒；上述成分都易分解或挥发，不具备持久抗菌性能。而季铵盐类消毒产品属于阳离子表面活性剂，常规采用浸泡、擦拭、冲洗或喷洒方式消毒物体表面，通过结合并破坏微生物的脂质与蛋白质，并改变细胞的渗透性而达到杀菌效果。相比于单一成分的季铵盐, 3种双长链季铵盐与1种单长链季铵盐复配的复合型季铵盐杀菌效果更优，抗干扰性更强，毒性较小，价格也较低，另外由于季铵盐具有气味适宜、腐蚀性低、稳定性好、不挥发、使用便捷及持久抗菌等特点，而被推荐用于医疗机构感染高风险部门的环境和物体表面的清洁与消毒[8]。研究[9-11]表明，季铵盐类消毒产品还可有效杀灭耐碳青霉烯类肠杆菌、泛耐药鲍氏不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等多重耐药菌，使用成本低于含氯消毒剂，是用于重污染消毒的最佳消毒剂。
对于医疗机构专业仪器设备表面消毒而言，研究[12-14]表明，用复合季铵盐类消毒湿巾不仅消毒效果可靠、持久抗菌效果佳，且不会对精密仪器设备造成损伤; 而75%乙醇这一传统消毒剂，其挥发性较强，造成杀菌效果不稳定，且成本较消毒湿巾增加80%以上；频繁使用含氯消毒制剂进行设备擦拭消毒，易腐蚀机器外壳，造成仪器设备磨损、老化，进而缩短设备使用寿命，此外还会对操作人员皮肤、黏膜等造成不同程度损伤，导致依从性不高。因此，复合季铵盐类消毒湿巾被大量应用于不耐腐蚀物体表面长期擦拭消毒[15]。此外，复合季铵盐类消毒湿巾即用即抽，使用便捷，依从性高[16], 开启后30 d仍能保持良好的消毒效果，且成本相对较低。
综上所述，复合季铵盐消毒液、消毒湿巾在较低浓度下均能高效灭活SARS-CoV-2。在需频繁进行消毒工作的疫情期间，使用复合季铵盐消毒液进行环境表面的日常消毒，以及使用复合季铵盐类消毒湿巾进行局部物体表面的清洁和消毒，如仪器设备和高频接触物体表面的消毒更为合适。本研究为疫情时期制订SARS-CoV-2的合理消毒措施和方案提供了一定理论依据。
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表 1 中和剂鉴定试验结果
组别 方法 每次试验TCID50的对数值 每组平均TCID50的对数值 第1次 第2次 第3次 1组 消毒液+病毒液+中和剂 0.50 0.50 0.50 0.50 2组 病毒液+中和剂 5.00 4.75 5.00 4.92 3组 病毒液+中和产物 4.50 4.50 4.75 4.58 4组 病毒液(阳性对照) 5.25 5.00 5.00 5.08 TCID50: 50%组织细胞感染量。 
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表 2 复合季铵盐消毒液对SARS-CoV-2病毒灭活效果
消毒液浓度 作用时间 1 min 3 min 5 min 864 mg/L(1∶500稀释) 有效灭活 有效灭活 有效灭活 432 mg/L(1∶1 000稀释) 有效灭活 有效灭活 有效灭活 有效灭活: 病毒液(阳性对照)病毒滴度对数值≥5.0时，细胞无病变，与阴性对照组细胞生长情况一致。
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表 3 消毒湿巾对SARS-CoV-2病毒灭活效果
试验病毒株 试验浓度 平均灭活对数值 平均TCID50的对数值 1 min SARS-CoV-2 挤出液原液 4.10 7.05 TCID50: 50%组织细胞感染量。
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