Research progress in animal model construction of Graves disease
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摘要: Graves病（GD）是一种器官特异性自身免疫病。目前，GD治疗存在诸多难点，包括药物治疗疗程长、复发率高、缓解率低等。GD动物模型是研究GD病因、发病机制和防治方法的重要工具。近年来，国内外研究通过更换造模材料，改变给药途径、时间与频次以及调整造模动物品系等多种方式，形成了多种有效的造模方法。本文就GD模型构建的现状和研究进展进行综述。Abstract: Graves disease (GD) is an organ-specific autoimmune disease. At present, there are many difficulties in the treatment of GD, including the long course of drug treatment, high recurrence rate and low remission rate. GD animal model is an important tool to study the etiology, pathogenesis and prevention of GD. In recent years, a variety of effective modeling methods have been developed by changing modeling materials, changing administration routes, time and frequency, and adjusting the strain of modeling animals. In this paper, the status quo and research progress of GD model construction were reviewed.
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Keywords:
- Graves disease /
- mice /
- model /
- pathogenesis
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Graves病(GD)是一种常见的自身免疫性甲状腺疾病，典型临床表现为高代谢症候群，甲状腺弥漫性肿大，部分患者可伴有Graves眼病或局限性胫前黏液性水肿[1]。GD的发病机制主要是促甲状腺激素受体(TSHR)与促甲状腺激素受体抗体(TRAb)结合，刺激甲状腺激素大量释放，甲状腺滤泡增生，从而导致甲状腺功能亢进[2]。其中TRAb是一种自身免疫性抗体，分为刺激性抗体(TSAb)以及阻断性抗体(TBAb)。在GD患者中，以刺激性抗体TSAb表达为主[3]。鉴于TSHR与GD发病相关，目前GD造模多以此为切入点。本文就GD模型构建造模材料、造模方法、造模成功指标等方面的研究进展进行综述。
1. 改进造模材料构建GD模型
TSHR可在体内产生抗原性抗体与抗原表位相结合，导致GD发生，故GD模型的构建多基于表达TSHR的基础。现有的造模方法主要包括采用表达TSHR的细胞、表达TSHR的质粒DNA以及表达TSHR的重组腺病毒。
1.1 表达TSHR的细胞免疫
1996年SHIMOJO N等[4]首次成功建立GD模型，研究者以携带人TSHR基因的真核表达载体转染RT4.15HP后的细胞为载体，免疫AKR/N(H-2K)小鼠，每2周免疫1次，共计6次，最终约25%的模型小鼠出现总甲状腺素(T4)水平增高、TSAb阳性及甲状腺弥漫性肿大，提示造模成功。此后，有学者[5]采用表达人TSHR和小鼠TSHR的M12(hM12、mM12)细胞免疫BALB/c小鼠，最终成功诱导TSAb、T4水平升高并出现典型甲亢症状; 而后应用表达TSHR的重组腺病毒转染树突状细胞并注射免疫BALB/c小鼠，亦成功诱导约25%的小鼠出现甲亢[1]。但以上造模方式繁琐，均需使用其他载体转染细胞后再免疫小鼠，且成模率较低、稳定性差等，逐渐淡出研究者视线。
1.2 表达TSHR的质粒DNA
表达TSHR的质粒DNA也可有效诱导GD发生。既往研究[3]发现，将表达TSHR的质粒DNA(pc DNA 3.1-TSHR)在小鼠双侧股四头肌注射，结果小鼠体内血清TRAb浓度增高, T4、TSAb水平均增高，而TBAb水平差异无统计学意义; 甲状腺组织呈现甲状腺滤泡增生、胶质浓缩等GD的病理表现，提示该质粒可有效建立GD小鼠模型。同样, XIA N等[6]采用pcDNA3.1质粒载体构建pcDNA3.1-T289重组质粒DNA, 使90%小鼠出现明显的甲状腺肿大和甲亢表现, 80%实验小鼠血清T4、TRAb水平显著升高合并甲状腺滤泡肥大和增生，同时MRI显像能明显观察到小鼠眼眶肌肉成纤维细胞增大，提示应用质粒DNA可成功构建GD小鼠模型。此外, pcDNA3.1-TSHR268重组质粒也可显著提高小鼠模型的TSHR水平[7], 但重组质粒免疫的小鼠常会出现甲减而非甲亢[8]。质粒DNA重组方式多样，一部分如pBacMam-2或pTriEx-1.1构建的质粒DNA, 具有更高的稳定性，但代价较高[9]。部分质粒DNA在短期实验中无法有效诱导小鼠发生GD[6]。上述不足限制了质粒DNA的应用，仍有待进一步完善。
1.3 表达TSHR的重组腺病毒
相对于质粒DNA载体，采用表达TSHR全长或TSHR A亚单位的重组腺病毒造模重复性更好，成模率更高。GD的发病是由于TSHR结构发生异常改变，在二硫键异构酶以及蛋白酶酶解作用下，连接A、B 2个亚单位的二硫键发生溶解断裂, TSHR-A亚单位脱落表达于细胞表面，诱发并增强自身免疫反应[10]。脱落出来的A亚单位三聚体结构与致病性TSAb的抗体具有更高的亲和力[11]。
CHEN C R等[12]在2003年构建重组腺病毒Ad-TSHR289, 造模成功率高达86%, 并具有高度可重复性，同时还发现应用表达TSHR-A亚单位的腺病毒比表达TSHR全长者具有更高的造模成功率, TSAb活性也更高。此后，研究者多采用表达TSHR-A亚单位的重组腺病毒进行造模。伍丽萍等[13]为比较表达TSHR的质粒DNA和腺病毒的造模效果，分别建立质粒组和病毒组小鼠模型，质粒造模组予pcDNA3.1-TSHR 50μg皮内注射，造模组予肌肉注射Ad-TSHR289, 重组腺病毒造模组中所有小鼠的TRAb和T4水平均升高, 8只小鼠中6只出现甲状腺增大、甲状腺滤泡组织增生等甲亢症状，而质粒造模组仅2只小鼠出现较弱TSHR抗体反应且总T4水平没有升高，甲状腺组织未发生增生性改变。另一研究[14]发现，应用TSHR重组腺病毒A亚单位长时间(3~4周)免疫BALB/c小鼠可以显著增加小鼠抗TSHR抗体滴度，促进TSHR依赖性cAMP水平提高; 同时能够促使小鼠出现典型甲状腺肿、甲状腺滤泡组织明显增大，且上述作用可维持长达9个月，此外，模型小鼠还出现了心脏肥大、心脏重量增加以及心动过速现象。以上研究表明重组腺病毒建立GD模型更稳定、成功率更高。尽管该法还需进一步改进，但仍是目前GD造模材料的最佳选择[15]。
2. 改进造模方法构建GD模型
2.1 改进给药途径
目前GD模型的制备可采用多种给药途径，主要包括腹腔注射、股四头肌肌肉注射、尾静脉注射以及电穿孔注射等方法。
早期采用表达TSHR的细胞免疫小鼠时，多采取腹腔注射细胞，但该法成模率低，逐渐被淘汰。肌肉注射是目前应用最广泛的给药方式，无论是采用表达TSHR A亚单位的腺病毒还是质粒DNA都可采用肌肉注射且效果较好。赵紫琴等[3]对BALB/c小鼠双侧股四头肌注射pcDNA3.1/hTSHR(188~403 bp)质粒DNA, 每3周1次，共免疫5次，在第2次免疫后发现小鼠T4、TRAb以及TSAb水平显著升高，病理显示甲状腺滤泡增生，提示成功建立了GD模型。
电穿孔(EP)载药也是造模的有效方法之一。电穿孔介导pC1-hTSHR289His-IRES-CD4载体免疫小鼠，可使其发生甲亢并可检测出高滴度TSAb抗体，且该抗体活性明显高于多数模型[16-17]。与构建病毒载体相比，电穿孔表达载体快捷、方便，无需建立表达或突变体的细胞系。重组质粒pcDNA3.1/TSHR268加电穿孔方法也可成功构建GD动物模型[18], 在造模第4周时，小鼠血清中T4、TRAb羧基端抗体和氨基端抗体水平均达到最高值，停止免疫后18周仍明显高于免疫前水平，提示电穿孔法或可延长GD的成模时间。不仅如此，电穿孔法还有助于诱发甲亢突眼，产生显著的眼眶肿大、肉眼可见的眼结膜水肿、眼眶血管扩张和堵塞[19]。故利用肌肉注射与电穿孔技术，通过表达载体重复免疫后，均可成功造模GD小鼠模型，成功率较高。目前，比较肌肉注射与电穿孔免疫的造模效果的研究较少，但有研究发现，通过电穿孔方法传导腺病毒会导致小鼠在最后1次免疫的4月后死亡[20], 故仍需更多研究证明两者的优劣性。
2.2 改变给药时间及免疫次数
GD小鼠免疫周期不完全一致，从2次免疫后2周到3次免疫后8周不等，但多集中在2次免疫后2周及3次免疫后4周。
研究[21]发现，每3周1次，共3次，末次免疫后4周造模为GD小鼠模型的最佳免疫周期，该免疫周期下，实验小鼠血清TRAb水平能达到最高水平, T4水平升高，并能持续8周。叶枫等[22]比较第2次免疫后2周与第3次免疫后4周的造模效果, 2组小鼠TRAb水平均明显升高，而其中3次免疫4周造模组的成模率(75%)最高，且其甲状腺组织改变与T4水平变化吻合度为100%。同样, CHEN C R等[11]选用重组腺病毒A亚单位免疫BABL/c小鼠，分别比较2次免疫后1周(5周造模)，末次免疫后4周(10周造模)及8周(14周造模)小鼠的TRAb及T4水平，结果发现5周造模组TRAb滴度及甲亢发生率与10周造模相似，而14周造模组的抗体水平及T4升高的阳性率略低于10周造模组，表明造模时间并非越长越好。HOLTHOFF H P等[14]发现利用重组腺病毒每3~4周进行一次免疫，连续免疫9次，可使模型维持时间延长至9个月，是迄今为止最长维持时间，提示造模时间及免疫次数对GD模型有重要影响。
2.3 调整动物品系
不同小鼠品系对相同抗体会产生不同反应, SAITOH O等[23]发现，使用AdTSHR289抗体免疫C57BL6以及BALB/c雌性小鼠时，小鼠体内均可产生TSAb抗体，但只有BALB/c小鼠会出现甲亢病征。与C57BL6小鼠相比, BALB/c小鼠能够产生更多的TSAb, 且能产生甲状腺组织的生理变化和眼眶组织的改变[24], 故BALB/c小鼠是目前研究GD造模的主要小鼠品系。此外，一种NOD. H2h4小鼠可自发产生免疫性甲状腺炎，甲状腺球蛋白抗体、以及甲状腺过氧化物酶抗体，但不能产生TSHR抗体，通过将人TSHR A亚单位转移至NOD. H2h4小鼠后，该转基因小鼠可自发产生TSAb[25-26], 为GD提供了新模型，但该小鼠模型研究较少，无法保证其可重复。通常情况下，雌性小鼠本身更容易出现自身免疫性疾病，但有研究[27]发现在相同的GD模型实验条件下，雄性小鼠TSH、FT4的表达水平会比雌性小鼠更高，但性别对于小鼠GD造模的具体影响尚不明确。此外，王悦等[28]通过肌肉注射重组腺病毒，将猕猴与小鼠进行GD造模对比，发现与猕猴相比，小鼠模型GD甲亢的诱导时间更短，发生率更高，同时GD猕猴基础生理生化指标和免疫相关指标中显示出更多与人类GD患者类似的表现及机制。该实验可为日后探索GD发病机制及评估新治疗方案研究提供新的造模动物类型，可以根据2种动物GD模型的不同特点选择更合适的研究工具。
3. 鉴定造模成功的指标
检测GD造模成功的指标有很多种，临床上GD主要以甲状腺毒症所致高代谢症状和体征、甲状腺弥漫性肿大、TRAb阳性，以及T3、T4水平增高和TSH水平降低为主。若症状不明确，可进一步测定放射性碘(RAIU)摄取率(增高)或进行甲状腺B超确诊[2]。
对于GD小鼠造模病理和指标变化可分为以下几个方面。①临床症状: 出现一系列甲亢临床表现如体质量减轻等; ②实验室指标: 甲状腺素水平增高或促甲状腺素水平降低; 血清TRAb阳性，尤其是TSAb水平; ③形态学变化: 甲状腺增大，甲状腺滤泡上皮细胞增生，滤泡胶质浓缩或乳头状增生等甲亢表现[29-30]。理想的GD小鼠模型需要同时具有生化指标变化和甲状腺病理变化。
4. 小结
GD的造模始终是当前疾病研究中的难点。近年来，经过多方面的探索，目前已能够成功建立一个长期并且稳定的GD小鼠模型。上述研究提示，经3次应用表达促TSHR-A亚单位腺病毒免疫BALB/c小鼠，免疫后4周造模效果最佳, TSHR抗体水平明显增高，血清T4水平升高，甲状腺滤泡上皮细胞增生肥大，滤泡腔中胶质含量减少或缺失等一系GD体征出现，为目前较为理想小鼠GD模型。
然而，不同研究者采取的终点时间并不一致，同类别小鼠以及相同免疫时间中免疫周期亦不相同，从2次免疫后2周到3次免疫后8周不等，部分实验免疫时间不足导致实验结果不够精准，缺乏可比性，故不同免疫时间及周期对于GD小鼠造模的影响并不全面，需要更多免疫时间和周期不同的GD小鼠造模实验以及同类型条件的对比，以提供更加合理且有效的模型。从给药途径来看，目前电穿孔造模成功率较高，但其操作难度较大且耗费较高，并有小鼠死亡个例，故肌肉注射可能更为经济且常用。此外，更多类别人工合成质粒DNA及重组腺病毒等造模材料有待发掘，为GD小鼠模型的构建提供更加高效、便捷的造模条件。目前对于小鼠品系的研究较少，常用小鼠仍为BALB/c小鼠，对于其他品系如NOD. H2h4等新型鼠种以及猕猴等其他动物种类，需进一步研究其可行性。转基因模型作为自发性的GD模型似乎具有更加广阔的前景，该模型可传代，可供深入研究母体及子代GD的发病机制。
综上所述，目前现有GD模型各有特点，但仍非理想的GD模型，例如伴有Graves眼病的模型仍不稳定，或者无法展现GD的多系统损害等表现。未来仍需更深入的研究以优化GD的造模方式，提高造模效率，为加深GD的病因学及发病机制的认识提供依据。
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