幽门螺杆菌(Hp)是定植于胃黏膜的一种革兰氏阴性杆菌，与胃炎、胃溃疡的关系密切，研究^[1]发现其与胃癌有关，是导致胃黏膜癌变的主要原因。自噬是维持细胞稳定的重要方式，在介导机体免疫应答、炎症反应、细胞正常生长和分化、细胞损伤和修复等病理生理活动中发挥重要的作用，但过度自噬会对细胞造成损害^[2]。研究^[3]表明, Hp可通过自噬途径损伤胃黏膜，诱导慢性炎症，进而导致癌变。凋亡是细胞在相关基因的调控下发生的正常死亡过程。研究^[4]表明, Hp VacA可影响细胞线粒体膜点位，诱导细胞凋亡。研究^[5]发现, Hp(+)胃黏膜细胞的凋亡发生率明显高于Hp(-)细胞。虾青素是天然存在的类胡萝卜素，具有抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等功效，已成为研究的热点。马于林等^[6]研究发现，虾青素可通过抑制氧化应激来抑制细胞凋亡。本研究通过构建Hp感染的胃上皮细胞株AGS细胞，加入不同浓度的虾青素，观察细胞自噬及凋亡的情况，现将结果报告如下。

1.   材料与方法

1.1   主要试剂、细胞株及仪器

人胃上皮细胞株AGS细胞(上海生命科学研究所); 虾青素(纯度>98%，长沙上禾生物科技有限公司); Hp标准株NCTC11637、SS1(中国疾病预防控制中心传染病预防控制所); Ham′s F12培养液、哥伦比亚琼脂培养基(Sigma公司，美国); 胎牛血清、双抗、胰蛋白酶(Biosciences, 美国); 兔抗人微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、LC3-Ⅰ、Beclin1、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、β-actin多克隆一抗、鼠抗兔单克隆二抗、FITC标记鼠抗兔抗体(Sigma公司，美国); Trizol试剂(江苏碧云天科技有限公司); LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax及DADPH引物序列(上海生工有限公司); RNA提取试剂盒、PCR试剂盒(武汉博士德生物公司); 白细胞介素-17(IL-17)酶联免疫检测试剂盒(南京奥尼多福公司); TUNEL原位凋亡细胞检测试剂盒、DAPI染色试剂盒(BioVision公司，美国); 酶标仪、倒置荧光显微镜(上海仪电分析仪器有限公司); ABI 7900PCR扩增仪(上海仪电分析仪器有限公司); Trans Blot转膜仪、化学发光成像仪(上海仪电分析仪器有限公司); 凝胶成像系统(UVP bioimaging systems，美国)。

1.2   细胞、Hp培养

含10%胎牛血清(FBS)和青霉素、链霉素各100 U/L的Ham′s F12培养基培养AGS细胞，培养条件为37 ℃、5% CO₂。待细胞铺满培养瓶后，用0.25%胰酶消化，制备单细胞悬液，使用血清培养基继续培养，定期更换培养基、传代。

吸取50 μL Hp菌种，均匀接种到哥伦比亚琼脂培养基中，放入37 ℃下10%CO₂、5%O₂、85%N₂培养箱中培养96 h。

1.3   抑菌试验

用培养液配成10 μmol/L的虾青素。在24孔板中加入10 μL Hp菌悬液(10⁹ cfu/mL)以及990 μL虾青素，空白对照组加入不含药物的培养液[含0.1%二甲基亚砜(DMSO)、10%FBS的培养液]和菌悬液，阳性对照组则加入含100 μg/mL阿莫西林和50 μg/mL克拉霉素混合抗生素的培养液和Hp菌悬液。37 ℃微需氧条件下培养24 h后，适当稀释，取50 μL转至哥伦比亚血琼脂培养基上，培养48 h后计数菌落。

1.4   Hp感染AGS细胞的方法及分组

选取第3代细胞, 0.25%胰酶消化，调整浓度为1×10⁶/L的单细胞悬液，接种于6孔板，每组设置5个复孔。Hp菌种培养24 h后，测定细菌浓度，更换新鲜培养基，并按照Hp菌落: 细胞数=100∶1加入Hp菌悬液, 37 ℃、5% CO₂共培养。更换培养液，保证每孔中培养液为2.0 mL, 将不同浓度的虾青素0.5 mL加入到6孔板中，对照组(虾青素0 μmol/L, DMSO代替), 10 μmol/L组(虾青素10 μmol/L), 20 μmol/L组(虾青素20 μmol/L), 50 μmol/L组(虾青素50 μmol/L)。细胞继续培养96 h, 用于后续实验。

1.5   免疫荧光检测Hp感染AGS细胞

取Hp感染的AGS细胞，去培养液, PBS冲洗, 3%多聚甲醛孵育10 min, PBS洗涤，用1%牛血清白蛋白(BSA)、22.52 mg/mL甘氨酸的磷酸盐吐温缓冲液(PBST)孵育细胞30 min以封闭抗体, PBS洗涤，加入外膜蛋白(OMP)单克隆一抗孵育4 ℃室温过夜, PBS洗涤，与相应荧光标记二抗反应, PBS洗涤，加入DAPI, 37 ℃孵育15 min, 弃染色液，甲醇洗涤; 加入甘油，激光共聚焦显微镜下观察。

1.6   实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax mRNA表达

对数生长期的细胞，胰酶消化，离心。加入等体积TRIzol试剂，根据试剂盒说明书提取总RNA, 溶于20 μL二乙基焦碳酸酯(DEPC)水，取1 μL加入79 μL DEPC水检测纯度。根据反转录试剂盒合成cDNA，样品总RNA 1 μg, 随机引物或oligo(dT)18-20为100 pmol, 脱氧核苷三磷酸(每种dNTP各10 mmol/L) 1 μL, 反转录缓冲液(5×) 4 μL, RNase抑制剂(20~40 U/μL) 1 μL, M-MLV反转录酶20 U, DEPC处理水补至20 μL, 目标引物序列见表 1。根据试剂盒说明书进行PCR扩增: cDNA 2 μL, 上、下引物各3 μL, Taq聚合酶0.5 μL, 总体积共25 μL, 反应参数设置为92 ℃ 20 s、96 ℃ 2 s、85 ℃ 20 s、80 ℃ 6 s, 共40个循环。构建溶解曲线。采用2^-△△Ct法计算目标引物mRNA的相对表达量。引物序列见表 1。

表  1  引物序列

引物名称		序列
LC3-Ⅱ	上游	5′-AAGCAACTCTGGATGGGATT-3′
	下游	5′-GCAGCCACAGGACGA AAC-3′
LC3-Ⅰ	上游	5′-GGAAGAGCACCGUGAUCAAdTdT-3′
	下游	5′-AACACGCCCGUGCCCAUGAACdTdT-3′
Beclin 1	上游	5′-AGCATTCCGTCTGACCATCA-3′
	下游	5′-ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG-3′
Bcl-2	上游	5′-GATACGAAGGGAGGGTGTACCA-3′
	下游	5′-CTCGGCCAGGGTGTTGAA-3′
Bax	上游	5′-CTGAAATTTATTGACAAACAGC-3′
	下游	5′-GCATCGAGAGAAGAGCAGGGACAT-3′
GAPDH	上游	5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′
	下游	5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′

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1.7   Western blot法检测LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白的表达

细胞经胰酶消化, 40 ℃下1 500转/min离心5 min, 去上清，超声波破核，离心，取上清液。配胶、上样、电泳、转膜、切膜，封闭液封闭1 h, 逐次LC3-Ⅱ(1∶500)、LC3-Ⅰ(1∶500)、Beclin1(1∶500)、Bcl-2(1∶100)、Bax(1∶100)、辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶100)。Bio-Rad成像仪曝光成像, Image Lab Software测定光密度，以目标蛋白与β-actin条带光密度值比值表示相对表达量。

1.8   TUNEL实验及ELISA检测IL-17浓度

取Hp感染的AGS细胞，去除培养液, PBS冲洗, 3%多聚甲醛孵育10 min, PBS洗涤，加入适量凋亡检测液, 37 ℃孵育60 min, PBS洗涤，加入DAPI室温避光孵育8 min, PBS冲洗，加抗淬灭剂，激光共聚焦显微镜下观察，计算凋亡率。细胞核呈蓝色，凋亡细胞呈绿色。

取各组AGS细胞, 3 000转/min离心10 min, 收集细胞上清, ELISA检测IL-17浓度。具体操作步骤严格按照说明书进行。

1.9   统计学分析

本研究采用SPSS 17.0软件处理数据，计量资料采用(x±s)表示，组间均数的比较釆用独立样本t检验，多组间均数的比较采用方差分析，假定方差齐性采用LDS检验，假定方差不齐性釆用Dunnett′s T₃检验。计数资料使用%表示，组间比较行χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   Hp感染AGS细胞

Hp在AGS细胞质中弥散分布，进行自我复制，提示Hp感染AGS细胞成功，并在细胞内增殖。见图 1。

图  1  激光共聚焦观察Hp感染AGS细胞(放大倍数40倍)

A: 细胞核DAPI染色(蓝色); B: Hp OMP蛋白染色(绿色); C: A、B合并图; D: Hp在AGS细胞内大量增殖的完整细胞图。

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2.2   虾青素对Hp增殖的影响

与对照组比较，虾青素对Hp增殖起到显著的抑制作用(P < 0.05), 但弱于抗生素组，差异有统计学意义(P < 0.05)。见图 2。

图  2  不同药物对Hp增殖的影响

与对照组比较, *P < 0.05; 与抗生素组比较, #P < 0.05。

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2.3   虾青素对Hp感染AGS细胞凋亡的抑制作用

虾青素10 μmol/L组细胞凋亡率为(1.11±0.03)%, 20 μmol/L组为(0.35±0.04)%, 50 μmol/L组为(0.22±0.03)%, 均低于对照组的(2.14±0.04)%, 差异有统计学意义(P < 0.01)。随着虾青素浓度的增高，细胞凋亡率逐渐下降，提示虾青素对Hp感染AGS细胞凋亡的抑制作用具有浓度依赖性。见图 3、4。

图  3  TUNEL染色检测各组细胞的凋亡细胞数(放大倍数10倍)

蓝色代表细胞核DAPI染色，绿色代表凋亡细胞染色。

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图  4  各组细胞的凋亡率比较

与对照组比较, **P < 0.01。

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2.4   虾青素对Hp感染AGS细胞LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin1、Bcl-2、Bax蛋白及mRNA的影响

虾青素10、20、50 μmol/L组细胞Bcl-2蛋白表达量高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01), 且随着浓度的增高，表达量逐渐升高。虾青素10、20、50 μmol/L组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ与LC3-Ⅰ比值(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)、Bax表达低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01), 且随着浓度的增高，表达量逐渐下降。

虾青素10、20、50 μmol/L组细胞Bcl-2 mRNA表达量高于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01), 且随着浓度的增高，表达量逐渐升高。虾青素10、20、50 μmol/L组细胞Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Bax mRNA表达低于对照组，差异有统计学意义(P < 0.01), 且随着浓度的增高，表达量逐渐下降。见图 5、6。

图  5  各组Bcl-2、Bax蛋白、mRNA的表达

A: Western blot结果; B: 蛋白表达量; C: mRNA表达量。与对照组比较, **P < 0.01。

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图  6  各组Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白、mRNA的表达

A: Western blot结果; B: 蛋白表达量; C: mRNA表达量。与对照组比较, **P < 0.01。

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2.5   虾青素对Hp感染AGS细胞IL-17的影响

虾青素10、20、50 μmol/L组IL-17含量依次为(102.12±21.92)、(91.02±11.23)、(72.23±12.34) pg/mL, 均低于对照组的(123.84±14.39) pg/mL, 差异有统计学意义(P < 0.05), 且随着浓度的增高, IL-17含量逐渐下降，提示虾青素对Hp感染AGS细胞的炎症抑制作用具有浓度依赖性。

3.   讨论

近年来，随着生物化学及提纯分离方法的进步，越来越多的天然药物获得分离，虾青素属于类胡萝卜素化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗凋亡等功效^[7-10]。研究结果^[11]显示，虾青素可激活过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)及其下游靶基因过氧化氢酶，减轻Hp感染AGS细胞的氧化应激及炎症反应。凋亡和自噬是细胞死亡的2种途径，但存在密不可分、相互作用的关系，在肿瘤发生、发展中起关键作用^[12]。

自噬是真核细胞维持细胞稳定、提供能量的过程，人体多种疾病与自噬相关。研究^[13]发现，自噬在胃黏膜细胞Hp感染导致癌变的发生、发展中发挥重要的作用。自噬过程受到多种因子调控，其中自噬相关蛋白在自噬过程中发挥不可替代的作用。Beclin1蛋白是启动自噬的重要蛋白，与PI3K形成结合体，调控Atg蛋白的位置，进而加速自噬体的形成^[14]。研究^[15]发现，胃癌组织中Hp感染与Beclin1表达有关，提示Hp可能通过自噬参与了胃癌的发生、发展。LC3位于自噬泡膜，参与自噬体的合成，与自噬泡的数量呈正相关。LC3主要包括Ⅰ型和Ⅱ型, LC3-Ⅰ代表了自噬前状态，发生自噬后, LC3-Ⅰ与自噬泡膜的PE结合形成LC3-Ⅱ^[16]。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及Beclin1是与自噬密切相关的蛋白，在自噬体形成中发挥至关重要的作用，可反映自噬活动，是研究自噬活动的特异性指标^[17]。本研究结果显示，加入虾青素后Hp感染AGS细胞Beclin1蛋白及mRNA表达量, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均降低，提示虾青素抑制了细胞的自噬过程。Hp介导的细胞自噬机制复杂，目前认为与活性氧、炎症因子的释放密切相关，虾青素作为一种天然化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，因而可以有效抑制自噬过程。

细胞凋亡是细胞在一系列基因激活下进行的一种死亡过程，通过这种过程，人体可消除无功能或异常细胞。Hp感染细胞后，会诱发细胞启动凋亡过程以清除被感染的细胞。TUNEL染色是最常用的一种凋亡研究方法，主要是通过特定的染料标记凋亡细胞，从而区分凋亡、正常细胞^[18]。本研究结果显示，虾青素能显著降低Hp感染后AGS细胞TUNEL的阳性表达率。Bcl-2家族是调控细胞凋亡的关键蛋白，主要包括抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Bax)。Bcl-2通过结合Bax蛋白，形成二聚体，使Bax蛋白处于失活状态，导致细胞不能启动凋亡途径^[19]。当Bcl-2表达被抑制后，则与Bax分离，引起凋亡的发生。雷艳杰等^[20]研究发现，胃癌组织中Bcl-2蛋白高表达，其含量与Hp感染呈正相关。蒋漫琦等^[21]研究结果表明, Bcl-2蛋白在Hp感染的慢性萎缩性胃炎组织中高表达。本研究结果显示，加入虾青素后, Bcl-2蛋白含量增加, Bax蛋白含量降低，且抑制作用具有浓度依赖性，进一步说明了虾青素可抑制Hp感染后AGS细胞的凋亡，且浓度越高，这种抑制性越强。岳亮等^[22]研究结果显示，虾青素可通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进胶质瘤细胞凋亡。Hp感染细胞过程中会发生氧化应激反应，产生大量的自由基，而虾青素具有抗氧化、清除自由基的功效，因而可以抑制细胞的凋亡过程。

IL-17是重要的促炎性细胞因子，其可诱导多种细胞释放炎症介质, IL-17不仅与炎性反应密切相关，还与消化道恶性肿瘤等相关^[23]。研究^[24]表明, IL-17广泛存在于乳腺癌、肝癌及胃癌等多种肿瘤中。IL-17具有促进肿瘤发生、发展的作用，同时肿瘤所处的微环境可直接诱导IL-17细胞因子。本研究结果显示，加入虾青素后IL-17含量降低，且抑制作用具有浓度依赖性，进一步说明了虾青素可抑制Hp感染后炎症反应，且浓度越高，这种抑制性越强。

综上所述，虾青素可抑制Hp感染后AGS细胞的凋亡及自噬过程，具有浓度依赖性，为Hp的治疗及胃癌的防治提供了新的思路。但本研究只是初步研究，具体机制有待深入、全面的探索。