Clinical application and prospect of circulating tumor DNA
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癌症严重威胁着人类的生命健康。中国人口众多，医疗设备及医护人员配置暂时无法与发达国家相比，大部分癌症患者在确诊时病情已经进展到中晚期，错过了最佳的治疗时机。随着医学水平的发展和提高，人们已经意识到有同样病症的患者对于同样的治疗手段的获益各异。导致患者获益效果不同的原因有多种，解决问题的关键在于以更精细的手段对癌症进行分类，针对每个患者制定专属的治疗方案。“精准肿瘤学”的提出正是为了改善癌症的诊断和治疗现状[1]。对基因组和其他分子进行分析，以获知肿瘤的分子亚型，选择对应的治疗方法，并对预后进行预判。临床上通常采用穿刺或者手术获取肿瘤组织进行分子性能分析，但有时患者身体情况不允许采用此类方法获得肿瘤组织，且此类方法也不适用于肿瘤的连续监测。因此，非侵袭方式的液体活检更能满足研究人员和精准医学的需求。
液体活检可以多次重复取样，监测整个疾病进程，以及时发现耐药、肿瘤转移和复发，迅速调整治疗方案。除此之外，也有多项研究项目利用液体活检技术进行癌症早期筛查。液体活检最初是描述从血液样本中获取与组织活检一样诊断结果的检测方法，后来扩展到以更多类型体液为检测对象的技术，如尿液、腹水和胸腔积液[2-4]。外周血的分析对象主要包含循环肿瘤细胞(CTCs)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、外泌体及循环RNA[5-8]。CTCs虽能提供完整的肿瘤细胞信息，但是不易捕获; 外泌体的提取及循环RNA的提取和保存具有一定的技术难度; ctDNA的捕获和检测是目前市场应用较多、流程较为成熟的液体活检技术。本研究对ctDNA的特点、检测技术、临床应用以及技术发展前景等方面做简要阐述与前瞻性探讨。
1. ctDNA概要及优势
1994年，研究[9]报道在胰腺癌患者的血液游离DNA中检测到KRAS基因突变，这与在患者肿瘤中的KRAS突变相同，从而证实了血浆中的DNA突变片段是来源于肿瘤，也就形成了“循环肿瘤DNA(ctDNA)”这一术语，是癌症的高度特异性标志物。最新研究[10-12]表明，ctDNA片段在90~150 bp的丰度有明显提高，根据ctDNA在各长度区间分布而建立模型可有效区分肿瘤血液样本和健康血液样本，有目的地富集ctDNA能使液体活检在更早期就检测到癌症。
坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞和肿瘤细胞外泌体都可能产生ctDNA, 因此ctDNA来源于多个不同肿瘤区域或者多个病灶处, ctDNA分析结果可以提供肿瘤基因组的综合描述，克服组织活检的异质性，补充组织样本中遗漏的突变[13-14]。ctDNA深度测序能发现只在部分细胞中出现的亚克隆突变，揭示具有独特基因组特征的特定分子亚型[15-18]。CTCs或组织样本想要获得同类水平信息则需要多个样本。ctDNA样本易采集，且不局限于血液，尿液、胸腹水、脑脊液等体液都可以纳入检测范围[19-22], 其保存和运输的研究成果也较为成熟，市面上已经有多个品牌的商业ctDNA保存管用于血液的采集保存，可长途运输，操作手法简单易行[23-25]。相较于RNA和外泌体, ctDNA的提取与保存操作难度低，很多实验室和医院都可以开展。
2. ctDNA检测技术平台
从单碱基突变到多基因突变检测，有很多检测方法可以灵活选择。目前适用于ctDNA临床检测常用的技术平台有ARMS-PCR平台、数字PCR(dPCR)平台和二代测序(NGS)技术平台。
突变扩增系统(ARMS)是由Newton等[26]首先建立并用于检测已知基因突变的方法。ARMS法可分为实时荧光定量PCR(qPCR)和巢式ARMS法电泳检测[27-28]。根据PCR引物3′端碱基必须与模板DNA互补才能进行有效扩增的基本原理，依据已知突变位点设计引物，使3′端碱基分别与突变和野生型模板碱基进行互补、扩增，以区分突变模板和野生模板。ARMS法具有高特异性、高灵敏度以及耗时短、成本低、操作简单等特点，其特异性的关键在于引物设计和PCR反应体系优化。
数字PCR概念诞生于1999年，包含PCR扩增和荧光信号分析两个部分。样品稀释后分配到大量微小的反应单元中，每个单元包含1个或多个拷贝的目标分子，通过PCR反应体系对目标分子进行扩增，然后对每个反应单元的荧光信号进行采集。考虑到有些反应单位元可能会包含2个或2个以上的目标分子，分析软件会应用泊松概率分布公式进行计算。不同于实时荧光定量PCR, 数字PCR无需参照，可以同时实现相对定量和绝对定量，检测灵敏度达到0.001%~0.01%[29-31]。根据反应单元类型不同，数字PCR可分为3类: 微反应室数字PCR, 借助高通量自动上样设备实现快速精确取样; 微流控芯片数字PCR，含有数千个超高密度亲疏水微孔芯片; 微滴式数字PCR，将含有目标分子的样品分成上千万个纳升级的油包水微滴，再对每个微滴进行扩增和荧光信号采集。由于数字PCR生成微滴内的模板数必须服从泊松分布，所以样本浓度需要控制在一定范围内。
ARMS和数字PCR只能针对已知突变位点设计引物进行检测，且一次检测的位点数有限。若需一次性地对多基因区域或未知突变进行检测，则要借助下一代测序技术(NGS)。ctDNA丰富较高时可选择全面的非特异性检测，如全基因组测序(WGS)、全甲基化测序、血浆全基因组测序和全外显子测序等。但大部分样本获得的ctDNA丰度较低，需要特异性富集。NGS的富集技术又分为靶向扩增子测序和目标序列捕获测序[32-33]。靶向扩增子技术是针对目的基因设计数对PCR引物，利用多重PCR扩增富集。目标序列捕获测序技术是针对目的基因设计探针，通过杂交捕获的方法富集再进行PCR扩增。NGS通量高，一次运行可对多个样本、多个基因区域、多种变异进行深度测序，检测灵敏度能达到0.01%~0.5%, 对于肿瘤诊断、治疗和监测具有重大意义[34-36]。相比于PCR, NGS技术和数据处理较为复杂，实验室水平间差异较大，其检测流程暂未标准化。
3. ctDNA在肿瘤临床方面的应用
ctDNA样本可多次重复获得决定了它可以贯穿疾病管理全周期，在肿瘤早筛、肿瘤诊断、用药指导、耐药监测、肿瘤转移和复发监测等各个领域发挥不同的作用。
疾病的发生、发展需要一个过程，肿瘤亦是如此。中国医疗资源本就不均衡，没有针对性的体检往往无法在早期发现肿瘤，而目前常用的早筛技术(如肠镜、胃镜)，因体验感不佳而导致受检者依从性差。若能在癌症早期或癌症转移之前确诊，可以提高肿瘤治愈率，改善患者生存状态。有研究[37-38]表明，能在患者癌症确诊2年前的唾液和血浆样本中检测到突变，华大基因也报道在NIPT检测中有发现一些孕妇的血浆样本含有异常变异并最后确诊为癌症，说明ctDNA在无创肿瘤早期诊断中的发展潜力。市面上现有的比较成熟的商业ctDNA肿瘤早筛试剂盒为Epigenomics公司的Septin9基因甲基化检测试剂盒、北京博尔诚的Septin9基因甲基化检测试剂盒和苏州为真的人Septin9基因甲基化检测试剂盒，就是基于临床筛查实验证明Septin9基因甲基化是结肠直肠癌早期发生、发展中的特异性分子标志物，主要用于大肠癌筛查。《中国早期结直肠癌筛查及内镜诊治指南》[39]也指出，中国一项大规模临床试验发现血浆Septin9基因甲基化检测诊断结直肠癌的敏感度和特异性分为74.8% 和87.4%, 高于同期进行的免疫化学粪便潜血试验检测。联合ctDNA液体活检和甲基化检测技术还可以用于确定肿瘤原发病灶，以ctDNA甲基化的CpG岛作为特定的检测标签，通过与各器官组织细胞DNA甲基化进行比对，快速检测肿瘤细胞并确定肿瘤在体内的生长位置，为早期干预提供参考信息。
组织活检是肿瘤诊断的金标准，但并不是所有患者的情况都允许进行组织活检。如果无法进行组织活检采集，医生可通过ctDNA检测对肿瘤进行分子分型诊断，依据结果分析而确定治疗方案。对于晚期肺癌患者来说，表皮生长因子受体(EGFR)突变可能意味着患者能从酪氨酸激酶抑制剂中获益，如吉非替尼、埃罗替尼等。ctDNA还可以用于选择免疫治疗方案, 2018年一项研究[40]显示，血液肿瘤突变负荷高(bTMB-H)的患者使用免疫治疗比其他患者有更长的无进展生存时间(PFS)和总生存期(OS), 该研究还发现同一个患者的组织TMB(tTMB)与bTMB呈显著正相关。2019年肺癌NCCN指南将TMB检测列为2A类推荐，以此指导免疫治疗方案。另外，液体活检可多次重复取样的特点代表它在疾病监测、用药监测及预后预测领域的广阔发展空间。已有研究[41-42]发现在非小细胞肺癌和高级别浆液性卵巢癌中肿瘤体积和ctDNA突变等位基因频率呈线性关系，通过ctDNA突变频率获知肿瘤大小信息，从而反映出疾病的发展状态和对治疗方案的反应。在一项肺癌研究项目[43]中，等体积血浆提取出的ctDNA浓度与肺癌患者的代谢肿瘤体积有很高的相关性。ctDNA丰度还可以评估免疫治疗疗效，对接受免疫治疗的28例晚期非小细胞肺癌患者进行检测，结果显示出现ctDNA缓解(将ctDNA突变丰度自基线下降50%定义为ctDNA缓解)的患者更容易临床获益[44]。此外，还可利用ctDNA检测结果建立分析模型，预测患者体内有无肿瘤残留、复发，对不同风险的患者进行更为个体化的治疗[45]。
4. ctDNA检测试剂盒获批现状
凯杰与阿斯利康合作开发的Therascreen EGFR Plasma RGQ PCR试剂盒是全球首个以“液体活检”进行登记的伴随诊断试剂盒，于2015年1月在欧洲推出。目前全球仅有6款ctDNA检测试剂盒获批，中国国家食品药品监督管理总局批准的3款ctDNA检测试剂都仅用于大肠癌早筛，暂时没有伴随诊断试剂。6款试剂所用的检测方法都是基于PCR，暂无NGS技术平台和dPCR技术平台。FDA和CFDA现批准的基于NGS技术平台的多基因检测试剂盒针对的样本类型都是FFPE。这预示体外诊断试剂的市场对液体活检技术的需求，以及研究机构应加强液体活检技术的临床验证。6款ctDNA检测试剂盒详情见表 1。
表 1 ctDNA检测试剂获批详情试剂名称 厂家 样本类型 批准机构 批准时间 Septin9基因甲基化检测试剂盒 Epigenomics 血浆 FDA 2016年4月 cobas EGFR突变测试V2 Roche FFPE和血浆 FDA 2016年6月 Therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit Qiagen 血浆 CE-IVD — Septin9基因甲基化检测试剂盒 北京博尔诚 血浆 CFDA 2014年11月 人septin9基因甲基化检测试剂盒 苏州为真 血浆 CFDA 2018年3月 Super-ARMSⓇEGFR基因突变检测试剂盒 艾德生物 血浆 CFDA 2018年1月 5. ctDNA临床应用展望
ctDNA在临床应用中显示出巨大潜力。健康人群的血浆游离DNA浓度为1~10 ng/mL, 理论上晚期癌症患者的血浆游离DNA浓度会增大，但个体差异会导致有些患者的游离DNA浓度很低，血浆中ctDNA的检出与肿瘤负荷相关联[41, 46]。采用分子条形码标记被测序的DNA片段可以提高测序的准确性; 或是在提取时富集特定大小片段的cfDNA，以提高ctDNA初始比例; 或是检测多种基因突变，联合确定阳性样本的cut-off值[32, 36, 41, 47]。目前商业检测机构都侧重于开发基于NGS对肿瘤基因组测序的方法，但更精准的肿瘤类型判读应该基于多个检测方法结果综合分析的基础上，例如从DNA、RNA、蛋白和表观遗传学对肿瘤进行基因组学、转录组学、表观基因组学、蛋白质组学和代谢组学等多方面的综合分析[48-52]。这些多参数结果分析可以更深入地了解分子突变在肿瘤分型中扮演的角色和功能，有助于发现新的肿瘤亚型和研发靶标新药。面对海量的测序数据库，可引入机器学习，探索数据中隐藏的信息宝藏[53]。
目前ctDNA临床应用最大的挑战之一就是检测结果的一致性和临床的有效性还未得到完全确认。有研究[54]使用不同的ctDNA检测方法对同一批样本进行检测，34个受检样本中仅有9个样本结果完全一致。另有研究人员比对了Guardant 360和PlasmsSELECT对40例胰腺癌患者的cfDNA检测结果, 25例检出有基因变化的仅3例结果完全一致。商业检测机构和研究人员需要联合起来进行多中心研究，使用足够大的患者群和样本数据来确认ctDNA检测的分析效度和临床有效性。
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表 1 ctDNA检测试剂获批详情
试剂名称 厂家 样本类型 批准机构 批准时间 Septin9基因甲基化检测试剂盒 Epigenomics 血浆 FDA 2016年4月 cobas EGFR突变测试V2 Roche FFPE和血浆 FDA 2016年6月 Therascreen EGFR Plasma RGQ PCR Kit Qiagen 血浆 CE-IVD — Septin9基因甲基化检测试剂盒 北京博尔诚 血浆 CFDA 2014年11月 人septin9基因甲基化检测试剂盒 苏州为真 血浆 CFDA 2018年3月 Super-ARMSⓇEGFR基因突变检测试剂盒 艾德生物 血浆 CFDA 2018年1月 
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