GKT137831 alleviates atorvastatin-induced decreased glucose uptake of skeletal muscle by suppressing reactive oxygen species level
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摘要:目的 探讨GKT137831对阿托伐他汀干预骨骼肌细胞的保护作用机制。方法 采用阿托伐他汀干预骨骼肌C2C12细胞48 h。采用CCK-8方法分析阿托伐他汀对骨骼肌细胞生存率的影响。采用Western blot检测阿托伐他汀干预后NADPH氧化酶4(Nox4)蛋白表达。采用流式细胞术检测阿托伐他汀对骨骼肌细胞糖摄取及活性氧自由基(ROS)水平的影响。予Nox4抑制剂GKT137831共培养，分析阿托伐他汀对细胞糖摄取及ROS水平的影响。结果 阿托伐他汀干预骨骼肌细胞48 h后, C2C12细胞糖摄取能力下降、ROS增加，予GKT137831后可缓解糖摄取下降及ROS增加。CCK-8实验结果显示，阿托伐他汀干预细胞48 h对细胞活力无影响。阿托伐他汀干预C2C12骨骼肌细胞后Nox4表达增加。结论 GKT137831通过降低ROS水平来缓解阿托伐他汀所致的骨骼肌糖摄取下降。Abstract:Objective To explore the mechanism of GKT137831 on protecting skeletal muscle cells by atorvastatin intervention.Methods Atorvastatin was used to intervene C2C12 cells in skeletal muscle for 48 hours. CCK-8 method was used to analyze the effect of atorvastatin on survival rate of skeletal muscle cells. Western blot was used to detect the expression of NADPH Oxidase 4 (Nox4) after atorvastatin intervention. Flow cytometry was used to detect the effect of atorvastatin on glucose uptake and reactive oxygen species (ROS) in skeletal muscle cells. Co-culture of Nox4 inhibitor GKT137831 was used to analyze the effect of atorvastatin on cellular glucose uptake and ROS level.Results After intervention with atorvastatin on skeletal muscle cells for 48 hours, the glucose uptake ability of C2C12 cells decreased and ROS increased. GKT137831 could alleviate the decrease of glucose uptake and the increase of ROS. CCK-8 results showed that atorvastatin had no effect on cell viability after 48 hours of intervention. Nox4 expression increased after atorvastatin intervention on C2C12 skeletal muscle cells.Conclusion GKT137831 can alleviate atorvastatin-induced decreased glucose uptake of skeletal muscle by suppressing reactive oxygen species level.
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Keywords:
- GKT137831 /
- atorvastatin /
- reactive oxygen species /
- glucose uptake
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腔道内镜外科手术治疗技术是一种具有较好美观性的微创治疗方法[1], 但手术操作难度比较大，极易导致患者出现腹腔感染和脏器穿孔等并发症，再加上腔道内镜外科手术治疗技术还不太成熟，因此无法广泛应用于临床治疗中。经单孔腹腔镜切除手术治疗不仅能够满足无瘢痕要求，还能够提升手术部位的美观效果，显著降低手术操作风险和难度，因而被广泛应用到临床治疗中[2]。本研究选取本院收治的胆囊结石患者作为研究对象，探讨经脐单孔与三孔法腹腔镜胆囊切除术临床疗效，现将结果报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院2017年6月—2019年6月收治的60例行胆囊切除术的患者，随机分为对照组与研究组，各30例。对照组男16例，女14例，年龄23~76岁，平均(45.3±2.6)岁; 研究组男18例，女12例，年龄24~78岁，平均(46.7±2.3)岁。2组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05), 具有可比性。
1.2 方法
对照组患者给予传统腹腔镜胆囊切除术。患者均于全麻后进行手术，本组患者均接受腹腔镜胆囊切除术治疗和气管内插管麻醉处理。患者采取仰卧位，左倾18 °左右，建立二氧化碳气腹，气腹压力保持在12 mmHg左右，在右肋缘下、剑突下与脐上置入弹簧钳、电钩和腹腔镜。腹腔镜入腹后探查腹腔情况，若腹腔粘连，则需要使用电凝沟进行切断分离处理，通过拉、拨和推等方式分离疏松粘连组织，使胆囊得以充分暴露。解剖操作重点在于辨认胆囊壶腹、胆总管、肝总管与胆囊管等[3]。手术操作人员需要使用弹簧钳将胆囊壶腹钳住后应用电钩进行分离解剖处理。首先，对胆囊前三角区进行解剖，以保证胆总管与肝总管充分暴露，之后对胆囊后三角进行解剖，以此确定胆总管和肝总管位置。将胆囊管与胆囊动脉分离后，使用生物夹进行夹闭与切断处理。
研究组给予经脐单孔腹腔镜胆囊切除术。患者在全麻下手术，选取脐部做一弧形切口，长度3~4 cm, 切开皮肤、皮下组织和筋膜，直至腹腔，置入多孔套管针，并且连接气腹装置。置入腹腔镜镜头(5 mm), 使用5 mm分离钳和抓持钳，将旋转功能且带有关节的分离钳置入到腹腔镜内，旋转形成曲柄状，便于后续操作[4]。将腹腔镜置入探查后，通过抓持钳将胆囊壶腹提起，进行胆囊三角区解剖，并且游离胆囊管和胆囊动脉，将胆囊管与胆囊动脉夹闭后，进行结扎切断处理[5]。使用加长电凝钩自胆囊床剥离胆囊后从脐部切口将胆囊取出。
1.3 观察指标
观察和记录2组患者手术指标，包括手术时间、术中出血量、住院时间、肠胃功能恢复时间、镇痛情况。记录2组患者术后使用镇痛药物的情况及术中出血量。统计2组患者治疗后视觉模拟评分量表(VAS)评分, 10分为极度疼痛, 0分为无疼痛感。
1.4 统计学方法
采用SPSS 20.0统计学软件处理和分析所有患者的数据资料，计数资料行χ2检验，采用百分比表示，计量资料行t检验，采用均数±标准差表示，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组患者手术指标比较
研究组术中出血量、术后住院时间、肠胃功能恢复时间显著优于对照组，手术时间显著长于对照组(P < 0.05), 见表 1。
表 1 2组患者手术指标比较(x±s)组别 n 手术时间/min 术中出血量/mL 住院时间/d 肠胃功能恢复时间/h 研究组 30 46.2±25.5* 18.4±3.4* 2.2±0.5* 21.4±1.2* 对照组 30 31.4±16.7 21.3±5.1 4.4±1.0 25.1±4.2 与对照组比较, *P < 0.05。 2.2 2组患者术后镇痛使用情况比较
干预后，对照组有3例患者使用镇痛药物，术后镇痛率为10.0%; 研究组有1例患者使用镇痛药物，术后镇痛率为3.3%。2组患者术后镇痛率有显著差异(P < 0.05)。
2.3 2组患者术后切口美观评分和疼痛评分比较
研究组切口美观评分和疼痛评分显著优于对照组(P < 0.05), 见表 2。
表 2 2组患者术后切口美观评分和疼痛评分比较(x±s)分 组别 n 术后切口美观评分 VAS疼痛评分 术后6 h 术后24 h 研究组 30 4.7±0.2* 5.6±1.0* 3.5±0.7* 对照组 30 3.8±0.6 7.1±1.5 5.4±1.1 VAS: 视觉模拟评分量表。与对照组比较, *P < 0.05。 3. 讨论
经单脐切口手术治疗最早出现于20世纪90年代，国外学者应用该项手术成功实施单路腹腔镜胆囊切除手术[6]。相比于三孔法手术治疗，这种新型手术治疗方法的优势主要有: ①术后脐部瘢痕隐匿性高，能够实现腹壁无瘢痕效果。②显著降低患者手术创伤，待至麻醉清醒后能够下床活动，患者术后疼痛感较弱，能够减少镇痛药物使用量。③缩短住院时间，减少患者治疗费用[7]。然而，经脐单孔腹腔镜胆囊切除术早期应用的成熟度比较低，且操作难度比较大，会延长手术治疗时间。由于腹壁部位比较薄弱，且具有较强的延展性，当患者结石体积比较大时，会显著缩短胆囊取出时间[8-9]。
与三孔腹腔镜手术治疗方法比较，经脐单孔腹腔镜胆囊切除术只需要做1个穿刺孔即可，且术后不需要放置引流管和胃管，能够显著降低患者术后感染率，还能够减轻术后不适感。这种手术治疗方法不会对患者造成较大损伤，并且能够降低由于穿刺所导致的肠管损伤、感染、切口疝和神经症状等相关并发症。目前，患者对手术治疗的美观性要求不断提升，应用经脐单孔腹腔镜胆囊切除术治疗，能够减少肋缘下与剑突下穿刺孔，且由于脐部位本身就存在瘢痕，属于自然孔道，可以隐藏手术切口，减少瘢痕。本研究术后随访显示，患者无显著不适感，只有部分患者肩部不适，给予布洛芬药物镇痛治疗。有研究比较分析了传统腹腔镜手术与经脐单孔腹腔镜胆囊切除术的术后疼痛，结果显示，经脐单孔腹腔镜胆囊切除术术后疼痛感显著较低。需要注意的是，临床上关于疼痛量表的评价方式还存在较大争议，有学者认为疼痛评价量表缺乏循证医学支持，因此还需要大量研究证实经脐单孔腹腔镜胆囊切除术的术后疼痛感情况。
经脐单孔腹腔镜胆囊切除术在单孔操作条件下会增加操作难度，因此需要注意以下几点: ①治疗器械的三角形排列方式便于组织牵拉以充分暴露手术区域，已成为传统手术治疗的原则[10-11]。本研究手术治疗中，研究组患者使用的关节可弯曲的分离钳能够建立三角区，降低手术操作难度，提升手术治疗舒适度。②腹腔镜处于平行视野区域内，并且呈现出直角形态，在操作角度下无法有效辨认器械尖端，增加了手术操作人员对深度和距离的判断[12-13]。所以，手术治疗期间需要应用可弯曲操作器械，由于手术距离和空间比较小，加之手术器械比较集中于脐部穿孔，且平行进出方式会导致腹腔镜手术器械为直线显示情况，因此丧失手术治疗的立体感和空间感。尤其是在应用腹腔镜器械时，会出现直线视野问题，降低操作精准度。③肥胖患者由于腹壁脂肪组织比较厚，影响了器械和操作孔的自由度，也增加了手术操作难度[14-16]。同时，手术治疗患者实施经脐单孔腹腔镜胆囊切除术对手术操作人员的要求也比较高。④目前手术治疗所应用的腹腔镜镜头的直径、角度和弯曲度选择性比较高，然而实际应用时极易受到器械、角度和光源影响，无法满足手术照明度要求。因此，在给予患者经脐单孔腹腔镜胆囊切除术手术治疗时，必须注重病例选择的合理性[17-20]。首先，患者应当满足传统手术治疗的适应证，且近期无急性炎症出现；其次，患者无上腹部手术史，手术区域无组织粘连情况; 再次，术前检查无胆管结石征象。
本研究结果表明，研究组术中出血量、术后住院时间、肠胃功能恢复时间显著优于对照组，说明经脐单孔腹腔镜胆囊切除术在胆囊结石患者中的应用价值较高。总之，与三孔法腹腔镜胆囊切除术比较，给予胆囊结石患者脐单孔腹腔镜胆囊切除术能够减少术后疼痛，操作安全性和满意度高。
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图 2 阿托伐他汀通过增加ROS水平致骨骼肌细胞糖摄取能力下降
A: 阿托伐他汀干预骨骼肌细胞48 h, 流式细胞仪检测提示ROS水平明显增加; B: 阿托伐他汀干预骨骼肌细胞可致细胞糖摄取能力显著下降。与对照组比较, **P < 0.01, ***P < 0.001。
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图 3 阿托伐他汀通过增加ROS水平致骨骼肌细胞糖摄取能力下降
阿托伐他汀干预骨骼肌细胞48 h, Western blot法检测提示Nox4蛋白表达显著增加。与对照组比较, ***P < 0.001。
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